實(shí)驗(yàn)五枯草桿菌蛋白酶活力測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)五枯草桿菌蛋白酶酶活力測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?加深了解酶活力的概念。三、2.學(xué)習(xí)掌握測(cè)定蛋口酶活力的方法。四、實(shí)驗(yàn)原理酶活力指酶催化某一特定反應(yīng)的能力。其大小可用在一定條件下酶催化反應(yīng) 進(jìn)行一定時(shí)間后，反應(yīng)體系中底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。酶活力單位是表示酶活力大小的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)規(guī)定酶活力單位(U) 為一定條件下每分鐘分解lpg酪氨酸所需的酶量。實(shí)驗(yàn)選用枯草桿菌蛋口酶水解酪蛋口產(chǎn)生酪氨酸的反應(yīng)體系。產(chǎn)物酪氨 酸在堿性條件下與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，該藍(lán)色化合物在680nm處 有最大光吸收，其吸光值與酪氨酸含量呈正比。因此通過測(cè)定一定條件下產(chǎn)物酪氨酸的含量變化，可計(jì)算出

2、蛋白酶的活 力。三、和試劑恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、試管及試管架、干燥濾紙、玻璃漏斗。 原料：枯草桿菌蛋白酶：稱取lg枯草桿菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L, pH7.5 磷酸緩沖液溶解并定容至100mL,震蕩15分鐘，使充分溶解，干紗布過濾，取 濾液冰箱備用。使用時(shí)視酶活力高低用緩沖液適當(dāng)稀釋。1. Folin-®：(可以直接購(gòu)買)在2 L磨口回流瓶中加入磚酸鈉(Na2WoO4 . 2H20)100g,鈕酸鈉 (Na2WoO4 . 2H2O)25g,蒸鐳水 700mL, 85%磷酸 50mL 以及濃鹽酸 1 OOmL,充 分混勻后，微火回流加熱10小時(shí)。再加入硫酸鋰150g,蒸憎

3、水50mL和液澳數(shù) 滴，搖勻后開口繼續(xù)煮沸15min,以驅(qū)趕過剩的漠。冷卻后加蒸鐳水定容至 lOOOmL,過濾，溶液呈黃綠色，置于棕色試劑瓶中暗處貯藏。使用前用標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液、酚豔為指示劑標(biāo)定酸度（約為2mol/L）,然后加水稀釋至lmol/L,即可使用。2. 0.2moI/L鹽酸溶液3. 0.04mol/L氫氧化鈉溶液4. 0.55mol/L碳酸鈉溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5 磷酸緩沖液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4. 12H2O）7.16g,用水定容至100 mL（A液）; 稱取磷酸二氫eft（Na2HPO4.12H2O） 3.12g,用水定容至10

4、0 mL （B液）。取A液 84mL, B液16mL混合后，得到0.2 mol/L pH 7.5磷酸緩沖液，可長(zhǎng)期存放。臨 用時(shí)稀釋10倍即可。7. 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（50Pg/mL）：稱取12.5 mg以烘干至恒重的酪氨酸， 用0.2 mol/L鹽酸約30 mL溶解后,蒸惚水定容至250 mL。8. 酪蛋白溶液（0.5%）：稱取1.25 g酪蛋白,用0.04 mol/L氫氧化鈉溶 液（20 mL）溶解，再用0.02 mol/L pH 7.5磷酸緩沖液定容到250 mL。四、操作步騾（一）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支（標(biāo)號(hào)0, 15）,按順序分別加入0.00, 0.20, 0.40, 0.60,

5、0.80 和1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,再用水補(bǔ)足到l.OOmL,搖勻后各加入0.55 mol/L碳 酸鈉5.0 mL,搖勻。依次加入Folin酚試劑1.00 mL,搖勻并計(jì)時(shí)，于30°C水 浴鍋中保溫15 min。然后680 nm處測(cè)定吸光值（以0號(hào)管作對(duì)照）。以酪氨酸含 量（pg）作橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）酶活力測(cè)定1酶反應(yīng)：取一支，加入2.0mL0.5%的酪蛋口溶液，于30°C水浴中預(yù)熱 5分鐘，再加入l.OmL已預(yù)熱好的枯草桿菌蛋口酶液，立即計(jì)時(shí)，水浴中準(zhǔn)確保 溫lOmin,從水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯酷酸溶液，搖勻靜置數(shù) 分鐘

6、，干濾紙過濾，收集濾液（樣品液）。另取一試管，先加入l.OmL已預(yù)熱好的 枯草桿菌蛋白酶液和2.0mL的10%三氯醋酸溶液，搖勻，放置數(shù)分鐘，再加入 2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30°C水浴保溫10min,同樣干濾紙過濾，收集 濾液（對(duì)照液）。以上兩過程，應(yīng)各做一次平行實(shí)驗(yàn)。2.濾液中酪氨酸含量的測(cè)定取3支試管，分別加入1.0 mL水、A液、B液，然后各加入5.0 mL 0.55 mol/L碳酸鈉溶液和1.00 mL Folin-酚試劑，搖勻按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法保溫并測(cè) 吸光度值。根據(jù)吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出A、B液中酪氨酸含量差值，即可 推算出酶的活力單位。五、計(jì)算酶活力單位數(shù)（Ufg）