植物生理生化指標(biāo)測定

1、小黑豆相關(guān)生理指標(biāo)測定1.表型變化：鮮重、株高、主根長和葉面積鮮重：取處理好的植株，擦十根和葉表面水分，測量整株植物的重量，每個測 6 個重復(fù)。株高：取處理好的植株，測量從根和莖分隔處到植株最高點的高度，記錄，每個測 6 個重復(fù)。主根長：取處理好的植株，測量從根和莖分隔處到主根最遠(yuǎn)點長度，記錄，每個測 6 個重復(fù)。葉面積：取處理好的植株，選擇第二節(jié)段的葉片，測量葉面積，葉面積測量方法 是測每個葉片最寬處長度作為葉的長，測葉片最窄處長度作為葉的寬，葉片長和 寬的乘積即為葉表面積。每個測 6個重復(fù)。2.總蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA ）和 H2O2 含量測定樣品處理：取 0.5g 樣品（葉片要去

2、除葉脈、根要先用活水活洗十凈），速在 液氮中凍存，在遇冷的研缽中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl （ pH7.4） 抽提，將抽提液轉(zhuǎn)移到 2ml 的 EP 管中，于 4C, 12000rpm 離心 15min,取上活， 保存在-20 C下，上活液可用于總蛋白、丙二醛（MDA ）、可溶性糖和 H2O2 含 量測定?？偟鞍诇y定 （Bradford 法） ： 樣品反應(yīng)體系 （800ul H2O+200ul Bradford+5ul樣品） ，空白對照為（800ul H2O+200ul Bradford ）。測定后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量，X代表

3、 OD595）,計算得出蛋白含量?？扇苄蕴菧y定：樣品反應(yīng)體系（1ml 蕙酮+180ul ddH2O+20ul 樣品提取液）； 空白對照（1ml 蕙酮+180ul ddH2O）,測定 OD625 后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線： Y=0.0345X+0.0204（Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量（ug）蕙酮配方：稱取 100mg 蕙酮溶于 100ml 稀硫酸（76ml 濃硫酸+30mlH2O）. 注意：濃硫酸加入水中時，一點一點遞加，小心濺出受傷。丙二醛（MDA）測定：在酸性和高溫條件下，丙二醛可與硫代巴比妥（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的 3,5,5-三甲基惡哇 2,4-二酮，在 532nm 處有最大吸收

4、波長，但 該反應(yīng)受可溶性糖的極大十?dāng)_，糖與 TBA的反應(yīng)產(chǎn)物在 532nm 處也有吸收，但 其最大吸收波長在 450nm 處。采用雙組分分光光度法，可計算出 MDA 含量。 MDA 的計算公式為：MDA （umol/L）=6.45OD532-0.56OD450.反應(yīng)體系為：400ul 0.6%TBA+350ulH2O+50ul 樣品，80 C 水浴 10min 后，測 OD532 和OD450。對照用 Tris-HCl.0.6%TBA 配方：稱取硫代巴比妥 0.6g,溶于少量 1M NaOH 中，待其完全 溶解后用 10%TCA （稱取 10gTCA 三氯乙酸，溶于 100ml 蒸僻水中，待其

5、溶解 即可）定容至 100ml。H2O2 測定 （二甲酚橙法） ： 樣品反應(yīng)體系 （82ul 溶液 A+820ul 溶液 B（A:B=1:10 ）+150ul 樣品提取液），30C 水浴 30min,測 OD560。標(biāo)準(zhǔn)曲線 為:Y=0.01734X-0.0555（Y 代表 OD560, X 代表 H2O2 含量）溶液A (200ml): FeSO4.7H2O 0.1835g (NH4)2SO4 0.0872g； H2SO4(濃硫酸18M)4.58ml ,加水定容。溶液 B (200ml):二甲酚橙 0.0234g；山梨醇 6g,加水定容到 200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD 和 CAT

6、 活性測定樣品處理：取 0.5g 樣品，速在液氮中凍存，在遇冷的研缽中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.0)(內(nèi)含有 20%甘油、1mmol/L ASA (抗壞血 酸)、1mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH (還原型谷 胱甘肽)、5mmol/L MgCl2)抽提，將抽提液轉(zhuǎn)移到 2ml 的 EP管中，于 4C, 12000rpm 離心 15min,取上活，保存在-20C 下，上活液可用于可溶性蛋白、SOD、 POD 和 CAT 含量測定。1mmol/L 的 ASA 配制：先配制 10mmol/L 的母液一稱取

7、176.13mg 的 ASA, 溶于100ml 的 Tris-HCl (pH7.0)中即可，然后稀釋 10 倍即可。1mmol/L的 DTT配制： 先配制 10mmol/L的母液一稱取 154.25mg的 DDT 溶于 100ml 的 Tris-HCl (pH7.0)中即可，然后稀釋 10 倍即可。1mmol/L 的 EDTA配制：用 30mmol/L的 EDTA稀釋 30 倍即可。5mmol/L 的 MgCl2 配制：稱取 MgCl2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl(pH7.0),即可。樣品提取液的配制(200ml):取 10mmol/L 的 ASA 母

8、液 20ml, 10mmol/L 的母液DTT20ml,取 30mmol/L 的 EDTA 母液 7ml,稱取 203mg 的 MgCl2.6H2O , 最后再量取20ml 的甘油，將最終體積定容到 200ml,即可?？扇苄缘?白測定(Bradford 法)：樣品反 應(yīng)體系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul樣 品 ) ， 空 白 對 照 為 (800ul H2O+200ul Bradford) 。 測 定 后 帶 入 標(biāo) 準(zhǔn)曲 線Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X 代表 OD595),計算得出蛋白含量。SOD 測定：SOD 活性的測定是根據(jù)照光時，體系中

9、產(chǎn)生氧自由基使硝基四 口坐藍(lán)還原成藍(lán)色甲(在 560nm 處有一吸收峰),而超氧化物歧化酶作為氧自由基的活除劑可抑制此反應(yīng)。？一個酶活單位定義為將硝基四哇藍(lán)的還原抑制到對照 一半(50 %)時所需的酶量。14.5mmol/L 的 dl-甲硫氨酸(分子量 149.21)(現(xiàn)用現(xiàn)配)：稱取甲硫氨酸 216.4mg,加少量 Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0)定容到 100ml,即 可。30mmol/L 的 EDTA (292.25)(現(xiàn)用現(xiàn)配)：稱取 EDTA 藥品 876.75mg,加 少量Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0

10、)定容到 100ml,即可。2.25mmol/L 的 NBT (硝基四哇藍(lán))(817.6)(現(xiàn)用現(xiàn)配)：稱取 NBT 藥品 183.96mg,加少量 Tris-HCl(pH7.0)溶解后，用 Tris-HCl(pH7.0)定容到 100ml,即 可。60umol/L的核黃素(376.36)(現(xiàn)用現(xiàn)配)： 先稱取 225.81mg的核黃素， 加少 量 50mMTris-HCl(pH7.4)溶解后，用 50mM Tris-HCl(pH7.4)定容到 10ml,配制成 60mmol/L的母液，然后取 100ul 至 U 100ml 的 Tris-HCl(pH7.4)中，即可配制成 60umol/L

11、的核黃素。測酶活的反應(yīng)介質(zhì)：測定前在 54ml 的 14.5mmol/L 的 dl-甲硫氨酸中分別加 入EDTA、NBT 和核黃素各 2ml,此為反應(yīng)混合液。酶活測定：在盛有 1.0ml 反應(yīng)液的試管中，加入適量的酶液（50ul）（以抑 制達(dá)50%作用酶濃度為最佳） 。 混勻后放在透明的試管架上， 于光照培養(yǎng)箱中準(zhǔn) 確照光 10min后，迅速測定 560nm處的光密度。以不加酶液照光液的為對照，計算反應(yīng)被抑制的白分比。按下式計算超氧化物歧化酶的活性 AX N酶活力 =-AOX W TX VX 50%式中：酶活力單位為每 min每 g鮮重酶活單位數(shù)；AO 為對照試管溶液在 560nm 處的吸光度

12、值； A為對照試管溶液在 560nm 處的吸光值與加入酶液的反應(yīng)液在 560nmft 的吸光值的差；N為酶液總體積；W為提取酶液的樣品鮮重 g；T 為照光時間 （10min） ；V為加入酶液的體積（ml）；POD 測定（愈創(chuàng)木酚法）：過氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。 在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分 光光度計測量生成物的含量。反應(yīng)混合液配制： 在 50ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCl （pH7.0） 緩沖液中加入 28ul 的愈創(chuàng)木酚，與磁力攪拌器上加熱攪拌直至愈創(chuàng)木酚溶解，再加入 19ul 的 30% 的 H2O2,混合均勻，4

13、C 保存。酶活測定：取反應(yīng)混合液 1.0ml,加入 0.1ml酶提取液，2min 前后，于 470nm 處測OD 值，每隔 1min 讀數(shù)一次，以每分鐘 OD值的變化表示 SW 舌大小。（測量 時再加入酶液）CAT 測定（H2O2 法）反應(yīng)緩沖液：20mM 的 H2O2,使用前在 25C 水浴中加熱 30min。酶活測定：取反應(yīng)液 1.4ml，加入 100ul 酶液，每加完一管立即計時，并迅 速在波長 240nm 下測定 30S、1min30S、2min30S 時的吸光度，以 Tris-HCl 的 作為空白。以 1min 內(nèi) A240 減少 0.1 的酶量為 1個酶活單位。代入酶活力公式，以O(shè)D*V/0.1*v*tFW 表示 CAT 活性，所有測定均重復(fù)三次。 OD 代表空白的吸光度-樣品管的吸光度；V 代表酶提取液的總體積，v代表測量是加入的樣 品體積；t 代表反應(yīng)時間 min, FW 代表樣品鮮重。0.1mol/LH2O2 配方：稱取 1.1333g 的 30%的 H2O2,加入 100ml 的 50mmol/L 的Tris-HCl（pH7.4），即可。也可以用 0.01%的 H2O2