植物組織MDA含量測(cè)定

1、植物組織MDA含雖測(cè)定、目的要求1 .掌握植物組織 MDA 含量測(cè)定的原理及具體測(cè)量步驟；2.深化理解 MDA 與逆境和衰老的關(guān)系，理解植物組織 MDA 含量測(cè)定的意義;3.了解膜脂過(guò)氧化、氧自由基和 MDA 形成的關(guān)系；4 .能夠根據(jù)待測(cè)材料的具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定 MDA 含量；5.學(xué)習(xí)分光光度計(jì)，低溫離心機(jī)等儀器的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物遭受逆境脅迫或衰老時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋 白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低，活性氧平衡失調(diào)及內(nèi)源激素平衡失 調(diào)等?；钚匝醮x失調(diào)直接導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的大量積累，從而引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)

2、導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物有二烯鑰合物、脂類過(guò)氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙 二醛(Malondialdehyde, MDA)是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還 能加劇膜的損傷。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過(guò)測(cè)定 MDA 了解膜脂過(guò)氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度 以及植物的抗逆性。MDA 在高溫及酸性環(huán)境下可與 2-硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色 的產(chǎn)物3,5,5-三甲基惡坐 2,4-二酮(Trimetnine)，乂名三甲川，該物質(zhì)在 532nm 處有最大光吸收，在 600nm 處有最小光吸收。由丁 TBA也可與其它物質(zhì)反應(yīng)，

3、 并在 532nm 處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響，同時(shí)測(cè)定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 與 600nm下的吸光度的差值計(jì)算 MDA 的濃度。即：A532 A600= C L式中，A532和 A600分別表示 532nm和 600nm處的吸光度值，C 是 MDA 濃度,需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)可能對(duì) MDA-TBA 反應(yīng)有干擾作用?？蒐 為比色杯厚度， =155L - mri1oim-1o用下列公式消除由蔗糖引起的誤差C (Hmol：1)=6.45”532 A600) 0.56 A450三、材料與設(shè)備1.材料：四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室

4、溫對(duì)照。2.儀器：(1)分光光度計(jì)；(2)冷凍離心機(jī)；(3)水浴鍋；(4)天平；(5)研缽；(6)剪刀；(7) 5ml 刻度離心管;(9)刻度試管(10ml); (10)鑲子；(11)移液管(5ml、2ml、 1ml); (12)冰箱。3.藥品0.05mol/L pH7.8 磷酸鈉緩沖液；5%三氯乙酸溶液：稱取 5g三氯乙酸，先 用少量蒸僻水溶解，然后定容到 100ml; (3) 0.5%的 TBA溶液：稱取 0.5g硫代 巴比妥酸，用 5%三氯乙酸溶解，定容至 100ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.MDA 的提?。喝悠?0.5g (W)，加入 2ml 預(yù)冷的 0.05mol/L pH7.8 的 磷酸

5、緩沖液，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到 5ml 刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈， 活洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至 5ml。4500rpm, 4 度，離心 10min, 上活液即為 MDA提取液，測(cè)量提取液的體積(V)。2.MDA 含量測(cè)定：吸 2ml (V2)的提取液丁刻度試管中(空白為 2ml 緩 沖液)，加入 3ml 0.5%的 TBA溶液，將試管放入沸水浴中煮沸 10 min (自試管 內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始計(jì)時(shí))。到時(shí)間后，立即將試管取出并放入冰浴中。 4500rpm, 4度，離心 10min,取上活液并量其體積(V1)。上活液丁 532nm、 600nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。3 .

6、結(jié)果計(jì)算：MDA(nmol g-1)=6.452 (A532-A600) V2 W式中，VI為反應(yīng)液總量(ml); V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量(ml); V為提取 液總量(ml);W為植物樣品重量(g)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告樣品處理重復(fù)A532A600-一-1、MDA 含重（nmol g ）高溫處理1二23平均標(biāo)準(zhǔn)差綠葉室溫對(duì)照123平均標(biāo)準(zhǔn)差黃葉高溫處理123平均標(biāo)準(zhǔn)差室溫對(duì)照123平均標(biāo)準(zhǔn)差六、思考題1.TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？2.提取液與 TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時(shí)間乂不能過(guò)長(zhǎng)？3 .為什么要測(cè)定反應(yīng)液在 600nm 下的吸光度？4.如果可溶性糖含量影響 MDA 含量的測(cè)定，你有什么辦法消除其影響？5.正常植物與衰老時(shí)相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。七、注意事項(xiàng)1.可溶性糖與 TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在 532 nm 也有吸收（最大吸收在 450 nm）, 當(dāng)植物處丁干旱、高溫、低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高，必要時(shí)要排除可溶