第二代和第三代慢病毒包裝系統(tǒng)---精品管理資料

1、第二代和第三代慢病毒包裝系統(tǒng)將HIV 1基因組中的順式作用元件（如包裝信號(hào)、長(zhǎng)末端重復(fù)序列）和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反 式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄 和整合所需的HIV-1順式作用序列。同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn) 及在此位點(diǎn)插入的目的基因。第一代包裝系統(tǒng)中，除vpu之外的輔助基因都被保留下來(lái)，Env包膜蛋白由 VSV-G蛋白代替，應(yīng)用VSV-G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì) 胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性。3質(zhì)粒

2、系統(tǒng)，包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒.其中包裝質(zhì)粒在 CMV啟動(dòng)子的控制下，表達(dá) HIV 21復(fù)制所 需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu ;包膜蛋白質(zhì)粒 編碼水泡性口炎病毒 G蛋白（VSV 2G）,應(yīng)用VSV 2G 包膜的假構(gòu)型慢病毒 載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍， 而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過(guò)高速離 心對(duì)載體進(jìn)行濃縮，提高了滴度；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的 順式序列，還保留350 bp的gag和RRE,并在其中插入目的基因或標(biāo)志基因（綠色熒光蛋白GFP）。在第二代系統(tǒng)中輔助基因vif、vpr、nef被進(jìn)一步剔除，這些輔助基因的去除 并不影

3、響病毒的滴度和感染能力，同時(shí)增加了載體的安全性.第二代系統(tǒng)中5'LTR 634bp , 3' LTR 634bp, 5' LTRf不需要強(qiáng)啟動(dòng)子。4質(zhì)粒系統(tǒng)。第三代系統(tǒng)中，tat調(diào)節(jié)基因也被剔除，對(duì)5' LTF®行了改造，換上了異源 啟動(dòng)子，從而不需依賴tat基因（Tat基因編碼蛋白可與LTR結(jié)合,增加病毒所有 基因轉(zhuǎn)錄率）；構(gòu)建自身失活的慢病毒載體（SIN）,即刪除了 U3區(qū)的3'LTR,使 載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出 RNA; 一些增強(qiáng)包裝病毒滴度的元件被加入，如 cPPT、WPRE。因此，第三

4、代 系統(tǒng)的安全性大大提升，進(jìn)一步減少重組成復(fù)制型病毒（RCV）的可能性。5' LTR （truncated） 181bp , 3'LTR （ A U3） 234bp , 5' LTRtf要有強(qiáng)啟動(dòng)子。4 質(zhì)粒 系統(tǒng).VSV-G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過(guò)高速離心對(duì)載體進(jìn)行濃縮，提高了滴度 a、包裝質(zhì)粒nvitrogen表達(dá)元件備注pLP1 Vectorgag/pol三質(zhì)粒第三代系統(tǒng)。兼容性好，能與多數(shù) 表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染包裝。pLP2 VectorRevPlp/VSVGVSV-GClontech表達(dá)元件備注Helper

5、1gag pro五質(zhì)粒第四代系統(tǒng).號(hào)稱無(wú)需濃縮達(dá)到 5*108IFU/ml。兼容型好。引入 Tet-off 誘導(dǎo)表達(dá)。Helper2vprpolHelper3VSV-GHelper4Tet-offHelper5tat-IRES revDidier Trono表達(dá)元件備注pMDLg/pRREgag/pol來(lái)自DidierTrono實(shí)驗(yàn)室，科研院校常 用系統(tǒng)。第三代系統(tǒng)，經(jīng)典骨架.1998pRSVRevRevpMD2.GVSV-G2th generationX達(dá)元件備注pCMV A 8.91gag/pol/tat/rev科研院校常用二代系統(tǒng)，也是Trono lab 構(gòu)建的.pMD VSV GVSV

6、-GpCMVVSV-GVSVGWeinberg RA , 2003 第二代系統(tǒng)psPAX2gag/polDidier TronoInvitrogen的3個(gè)質(zhì)粒與DidierTrono的第三代系統(tǒng)的3個(gè)質(zhì)粒相同。第三代慢病毒載體系統(tǒng)由4個(gè)質(zhì)粒構(gòu)成，分別是：(1) 1個(gè)具有目的基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒.表達(dá)質(zhì)粒包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息.目的基因兩側(cè)各有一個(gè)LTR (long terminal repeat) 序列，LTR序列促使目的基因整合到目的細(xì)胞基因組里。為了提高安全性能，表 達(dá)質(zhì)粒的3' LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因組失去自我復(fù)制能力。(2) 2個(gè)包裝質(zhì)粒。其中一個(gè)質(zhì)粒編碼 Rev,另外一個(gè)質(zhì)粒編碼 Gag和Pole (3) 1個(gè)編碼包膜蛋白的質(zhì)粒.將上述4個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞.GAG®因編碼約500個(gè)氨基酸組成的p55蛋白 前體，經(jīng)蛋白酶裂解形成病毒的核衣殼蛋白(p7)、內(nèi)膜蛋白(p17)和衣殼蛋白 (p24)。POL!因編碼聚合酶前體蛋白，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H.REV基因編碼Rev蛋白。表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生慢病毒基因組 mRNA Rev蛋白與慢病毒基因組 mRNA的RRE吉合，將基因組mRNAl細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì) 胞質(zhì)中?；蚪MmRNAf衣殼蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、包膜蛋白等組裝成假病毒顆