CRISPRCas9精細(xì)原理基因敲除點(diǎn)突變基因插入解讀

1、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9大全：大全：基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入2015-10-15pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介系統(tǒng)簡(jiǎn)介pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用技術(shù)系統(tǒng)的應(yīng)用技術(shù)pCRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景系統(tǒng)的應(yīng)用前景1. CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介系統(tǒng)簡(jiǎn)介1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史系統(tǒng)的研究歷史p 1987 年，日本課題組在年，日本課題組在K12 大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的

2、基因組中，隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，2002 年，年，正式將其命名為正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列重復(fù)序列p 2005 年發(fā)現(xiàn)年發(fā)現(xiàn)CRISPR 的間隔序列的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò)CRISPR 系統(tǒng)可能以類似于真核生物的系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi 方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。p 2007 年，年，Barrangou 等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR 系統(tǒng)抵抗噬菌體

3、入系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；侵；2008 年，年，Marraffini 等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR 系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR 系統(tǒng)的功能系統(tǒng)的功能p 2013 年初，年初，MIT 的研究組首次利用的研究組首次利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)人系統(tǒng)對(duì)人293T 細(xì)胞細(xì)胞EMX1 和和PVALB 基因以及小鼠基因以及小鼠Nero2A 細(xì)胞細(xì)胞Th 基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年年Mali 利用利用CRISPR/ Cas9 在人在人293T 細(xì)胞和細(xì)胞和K652 細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈

4、或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA 修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。點(diǎn)插入。 1.2CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)pCRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括: 由不連續(xù)的重復(fù)序列R( repeat) 與長(zhǎng)度相似的間區(qū)序列S( spacers) 間隔排列而成的CRISPR 簇，前導(dǎo)序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相關(guān)蛋白基因cas。 CasCas蛋白是一種雙鏈蛋白是一種雙鏈DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與與folkf

5、olk酶功能類似，但是它并不需要形酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。成二聚體才能發(fā)揮作用。1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理系統(tǒng)的作用機(jī)理p CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得 首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源 DNA 潛在的 PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理系統(tǒng)的作用機(jī)理p CRIPSR 基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工) 當(dāng)該

6、噬菌體再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR 簇首先轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。pCRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾 crRNA 結(jié)合相關(guān)的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas 蛋白對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行斷裂和降解。1.3 CRISPR-CAS 1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理系統(tǒng)的作用機(jī)理2 2、CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用系統(tǒng)的應(yīng)用2.1 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組精確編輯介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù)技術(shù)p 基因組編輯技術(shù)是一種可以在基

7、因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。p 這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。p 通過(guò)修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因p 基因組編輯是研究基因功能的重要手基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)生物學(xué)的研究熱點(diǎn)2.1 2.1 CRISPR-CasCRISPR-Cas9 9介導(dǎo)的基因

8、組精確編輯技術(shù)介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù) CRISPRs技術(shù)是一種由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。 Mali 等人 利用來(lái)自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR 相關(guān)蛋白Cas9，在一段人為重組的sgRNA( small-guide RNA) 的引導(dǎo)下，針對(duì)小鼠和人類基因組的特定基因片段實(shí)現(xiàn)了精確的剪切。這種通過(guò)可編程RNA 進(jìn)行DNA 改造的技術(shù)為基因組編輯開(kāi)創(chuàng)了一條新的途徑。例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列。2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。3、轉(zhuǎn)化感受

9、態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證。4、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染5、敲除效果檢測(cè)。6、建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活p 在在CRISPR/Cas9的的型系統(tǒng)中將型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會(huì)使中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白蛋白失去對(duì)的切割活性，但不影響其與失去對(duì)的切割活性，但不影響其與 結(jié)合的能力結(jié)合的能力。這種失。這種失去切割活性的去切割活性的Cas9蛋白被命名為蛋白被命名為Dead as9。將。將Cas9與與gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)可以介導(dǎo)Cas9蛋白與蛋白與 結(jié)合。結(jié)合

10、。如果如果Cas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；聚合酶的延伸作用；如果如果Cas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始2.2CRISPR/Cas92.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活p CRISPRCas9系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)錄抑制需要PAM（bp）和至少12bp的gRNA配對(duì)p 利用cr介導(dǎo)dCas9能夠精確識(shí)別靶基因的特點(diǎn)，將Cas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPRon系統(tǒng)。p 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過(guò)將Ca

11、s9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子16結(jié)合獲得。3 3、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景3.1CRISPR-Cas93.1CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)p而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，CRISPRs比TALENs更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個(gè)核苷酸就行。p只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。p編碼sgRNA的序列不超過(guò)100bp，因此比構(gòu)TALENs和ZFNs更簡(jiǎn)單方便。p較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)TALENs編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥。3.2 CRISPR-Cas93.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景系統(tǒng)的應(yīng)用前景p目前應(yīng)用CRISPR-Cas9系統(tǒng)的研究主要集中在基因編輯方面。而Cas9真正的優(yōu)勢(shì)主要在于它具有能夠?qū)⒎N主要生物聚合物（、和蛋白質(zhì)）結(jié)合在一起的特殊能力。p各種功能性蛋白都可以通