分子生物研究法(上)

1、第五章第五章 分子生物學(xué)研究法（上）分子生物學(xué)研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù)從從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕ɑ虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分?jǐn)U增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。子生物學(xué)

2、研究的核心技術(shù)。 基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。中的繁衍與性狀表達(dá)。 事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物

3、的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。5.1 重組重組DNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用5.5 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù)5.6 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.1.1 三大奠基三大奠基成就成就 ：DNA的結(jié)構(gòu)及復(fù)制；的結(jié)構(gòu)及復(fù)制；5.1 重組重組DNA技術(shù)發(fā)展史回顧技術(shù)發(fā)展史回顧DNA是遺傳物質(zhì)；是遺傳物質(zhì)；DNA的遺傳和表達(dá)規(guī)律的遺傳和表達(dá)規(guī)律中心法則。中心

4、法則。40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；BacterialStrainInjectionResultsLiving S cellsLiving R cellsHeat killed S cellsHeat killed S cells mixed with living R cellsLiving S cells in blood sample from dead mousecapsule1928 Frederick Griffith &1

5、944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae 1952年Hershey和Chase證實(shí)噬菌體DNA侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)50年代揭示了年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；X-ray sourceCrystallized DNARosalind FranklinMaurice WilkinsPhotographicfilm1953- Franklin & WilkinsDescription of t

6、he 3-D structure of DNAFrancis Crick & James WatsonConservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway50年代末至年代末至60年代，

7、相繼提出了年代，相繼提出了中心法則中心法則和操縱子學(xué)和操縱子學(xué)說說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。和表達(dá)。Jacob and Monod DNA DNA提取技術(shù)：提取技術(shù)： 如果沒有分離和富如果沒有分離和富集單一集單一DNADNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無法分子的技術(shù)，科學(xué)家就無法對這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。對這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。 5.1.2 DNA 5.1.2 DNA操作技術(shù)操作技術(shù)DNA的體外切割和連接的體外切割和連接1962年年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了發(fā)

8、現(xiàn)了 DNA 連接酶連接酶DNA ligase covalently links two DNA strands RestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3535Herbert Boyer, Paul Berg(美國斯美國斯坦福大學(xué)坦福大學(xué) )于于1972年獲得年獲得第一個(gè)重組第一個(gè)重組DNA分子分子H. BoyerP. BergSV40 DNARecombinant DNA 僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接連接酶進(jìn)行酶進(jìn)行DNA的切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需的切割和重組遠(yuǎn)不能滿足基因研究的需

9、要。要。 DNA片段在體外片段在體外不具備自我復(fù)制不具備自我復(fù)制能力，要想得到能力，要想得到足夠量和足夠純度的足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備，必須將它們連接到具備自主復(fù)制能力的自主復(fù)制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。 這就是基因克隆，或分子克隆這就是基因克隆，或分子克隆 。 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù) 分子克隆的載分子克隆的載體體-具備自主具備自主復(fù)制能力的復(fù)制能力的DNA分子（分子（vector），如），如病毒、噬菌體病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都子量復(fù)制子都可以作為基因可以作為基因?qū)氲妮d體

10、。導(dǎo)入的載體。大腸桿菌成為分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。大腸桿菌成為分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年年Mandel和和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量CaCl2處理處理后，能有效地吸收后，能有效地吸收噬菌體噬菌體DNA。1972年，年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)等人又報(bào)道，經(jīng)CaCl2處理的大腸桿菌細(xì)處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。1973 - Boyer, Cohen & ChangTransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHer

11、bert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies非洲爪蟾非洲爪蟾表明：表明： （1 1）像）像pSC101pSC101這樣的質(zhì)粒這樣的質(zhì)粒DNA

12、DNA分子可分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源以作為基因克隆的載體，從而把外源DNADNA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；導(dǎo)入寄主細(xì)胞；（2 2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；中并實(shí)現(xiàn)其功能表達(dá)；（3 3）質(zhì)粒）質(zhì)粒DNA-DNA-大腸桿菌細(xì)胞作為一大腸桿菌細(xì)胞作為一種成功的基因克隆體系，在重組種成功的基因克隆體系，在重組DNADNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。或基因工程研究中發(fā)揮重要作用。重組重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶酶酶 類類功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸

13、內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNADNADNA連接酶連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片段連接成一個(gè)片段連接成一個(gè)DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大腸桿菌）（大腸桿菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNADNA雙鏈中的缺口雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶按照按照RNARNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNADNA鏈鏈多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5-OH5-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記末端（進(jìn)行

14、末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNADNA的連接的連接末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的在雙鏈核酸的33末端加上多聚單核苷酸末端加上多聚單核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII從從DNADNA鏈的鏈的33末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸噬菌體噬菌體DNADNA外切酶外切酶從從DNADNA鏈的鏈的55末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA鏈鏈55或或33末端的磷酸基團(tuán)末端的磷酸基團(tuán) 到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳

15、技術(shù)將這些片段按照分子量大成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。小逐一分開，以供下一步研究。 DNA的核苷酸序列分析技術(shù)的核苷酸序列分析技術(shù) DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)展起來的一門重要的學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)展起來的一門重要的DNA技術(shù)技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與學(xué)，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價(jià)值。著十分廣泛的使用價(jià)值。5.1.3 重組

16、重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件技術(shù)歷史上的主要事件 年份年份事事 件件 1869F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T. Avery證實(shí)證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。是遺傳物質(zhì)。1952A.D. Hershey和和M.Chase再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是再次證實(shí)和噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。1953J.D.Watson和和F.H.C.Crick提出提出DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。M.Wilkins用用X-射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。射線衍射法證實(shí)了這一結(jié)構(gòu)。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA

17、聚合酶聚合酶I。1958M. Meselson和和F. W. Stahl提出了提出了DNA的半保留復(fù)制模型。的半保留復(fù)制模型。1959-1960S. Ochoa發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNA，并證明，并證明mRNA決定了蛋決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；破譯了第一相遺傳密碼；F. Jacob和和J. Monod提出了提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964 C. Yanofsky和和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序

18、列存在著共線性關(guān)系。該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；的全序列測定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由質(zhì)粒質(zhì)粒DNA所決定。所決定。1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破等人破譯了全部遺傳密碼。譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶。內(nèi)切酶。H.M.Temin和和D.Baltimore從從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)腫

19、瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發(fā)展了等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于重組技術(shù)，于72年獲得第一年獲得第一個(gè)重組個(gè)重組DNA分子，分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與與A.Maxam、W.Gilbert等人發(fā)明了等人發(fā)明了DNA序列測定技術(shù)。序列測定技術(shù)。1977年完成了全長年完成了全長5387bp的噬菌體的噬菌體174基因組測定?；蚪M測定。1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。島素。1980美國聯(lián)邦最高

20、法院裁定微生物基因工程可以專利化。美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R. D. Palmiter和和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物-胰島素；胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。全序列測定。1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。的專利。1986 GMO首次在環(huán)

21、境中釋放。首次在環(huán)境中釋放。1988 J. D. Watson出任出任人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃首席科學(xué)家。首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠-Oncomouse。1992 歐共體歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組完成了酵母基因組(1.25107bp)全序列測定。全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測定。完

22、成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個(gè)人類基因組全序列測定。完成第一個(gè)人類基因組全序列測定。2004中國科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測定。中國科學(xué)家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完黑猩猩基因組全序列測定。中、美、日科學(xué)家聯(lián)合完黑猩猩基因組全序列測定。5.1.4 基因克隆技術(shù)及其相關(guān)概念 酶簡介 載體簡介 細(xì)菌轉(zhuǎn)化及篩選 鑒定重組子 基因克隆舉例限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)(restriction end

23、onuclease, RE)一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶 分類分類:、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；斜體第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；斜體第四個(gè)字母代表菌株；第四個(gè)字母代表菌株；羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)

24、回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)結(jié)構(gòu)，是 DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口 DNADNA連接酶連接酶: : 通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片片斷連接成一個(gè)整體斷連接成一個(gè)整體DNADNA分子。分子。 T T4 4DNADNA連接酶連接酶 E.coli -DNAE.coli -DNA連接酶連接酶 T T7 7DNADNA連接酶連接酶目

25、的基因的來源目的基因的來源 原核細(xì)胞原核細(xì)胞 真核細(xì)胞：真核細(xì)胞：cDNA或或gDNA文庫文庫 人工合成及人工合成及PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因 天然天然DNADNA（染色體（染色體DNADNA、病毒、病毒DNA(DNA(噬菌體噬菌體DNA)DNA)、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、線粒體、線粒體DNADNA和葉綠體和葉綠體DNADNA） 重組實(shí)驗(yàn)中的主要載體重組實(shí)驗(yàn)中的主要載體定義：定義：為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)蛋白質(zhì)所采用的一些達(dá)蛋白質(zhì)所采用的一些DNADNA分子。分子。克隆載體克隆載體(cloning vector)(cloning vector)為

26、使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) (expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 能自主復(fù)制能自主復(fù)制； 具有兩個(gè)以上的具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選物，便于重組體的篩選和鑒定；和鑒定； 有多克隆位點(diǎn)有多克隆位點(diǎn)（外源（外源DNADNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單插入點(diǎn)），常具有

27、多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNADNA。 噬菌體載體：噬菌體載體：雙鏈DNA病毒，約50kb,兩端有一個(gè)12個(gè)核苷酸5端突出粘性末端 噬菌體噬菌體噬菌體載體的特點(diǎn)：噬菌體載體的特點(diǎn)：1 1、克隆的、克隆的DNADNA有大小限制。有大小限制。2 2、和外源、和外源DNADNA連接后，都要經(jīng)過體外包裝過程，連接后，都要經(jīng)過體外包裝過程，把重組的把重組的DNADNA包進(jìn)頭部，和尾部裝配成有感染性包進(jìn)頭部，和尾部裝配成有感染性的噬菌體。的噬菌體。3 3、如果沒有外源、如果沒有外源DNADNA插入，載體本身的插入，

28、載體本身的DNADNA太小太小是不能被包裝的，這樣可確保轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的空是不能被包裝的，這樣可確保轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的空斑是重組體。斑是重組體。4 4、重組的、重組的DNADNA由于利用噬菌體把它注入細(xì)胞由于利用噬菌體把它注入細(xì)胞中，因此和重組質(zhì)粒中，因此和重組質(zhì)粒DNA DNA 轉(zhuǎn)化相比，具有高得轉(zhuǎn)化相比，具有高得多的轉(zhuǎn)化率。多的轉(zhuǎn)化率。Cos質(zhì)粒載體：又叫粘粒載體（質(zhì)粒載體：又叫粘粒載體（cosmid），是），是帶有帶有 cos 位點(diǎn)的質(zhì)粒，是由位點(diǎn)的質(zhì)粒，是由噬菌體的粘性末端噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建而成。和質(zhì)粒構(gòu)建而成。 柯斯質(zhì)粒載體含有來自質(zhì)?？滤官|(zhì)粒載體含有來自質(zhì)粒的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記

29、、一個(gè)或多個(gè)限的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、抗藥性標(biāo)記、一個(gè)或多個(gè)限制酶單一位點(diǎn)，以及來自制酶單一位點(diǎn)，以及來自噬菌體粘性末端的噬菌體粘性末端的 DNA 片段，即片段，即 cos 位點(diǎn)，其對于將位點(diǎn)，其對于將 DNA 包裝包裝成成噬菌體粒子是必需的。噬菌體粒子是必需的。結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖 cos質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：柯斯質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)： 具有噬菌體的高效感染力，而在進(jìn)入宿主細(xì)胞后具有噬菌體的高效感染力，而在進(jìn)入宿主細(xì)胞后不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在；不形成子代噬菌體僅以質(zhì)粒形式存在； 具有質(zhì)粒具有質(zhì)粒 DNA 的復(fù)制方式，重組的復(fù)制方式，重組 DNA 注入宿注入宿主細(xì)胞后，兩個(gè)主細(xì)胞后，兩個(gè)

30、 cos 位點(diǎn)連接形成環(huán)狀位點(diǎn)連接形成環(huán)狀 DNA 分子，分子，如同質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制；如同質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制； 具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源 DNA 的能力，柯斯質(zhì)粒本的能力，柯斯質(zhì)粒本身一般只有身一般只有 57kb 左右，而它可克隆外源左右，而它可克隆外源 DNA 片片段的極度限值竟高達(dá)段的極度限值竟高達(dá) 45kb ，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體及，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過質(zhì)粒載體及噬菌體載體的克隆能力。這是其最大優(yōu)點(diǎn)。噬菌體載體的克隆能力。這是其最大優(yōu)點(diǎn)。黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC ：高容量載體高容量載體單個(gè)克隆載體所容納的外原單個(gè)克隆載體所容納的外原DNA片段的大小片段的大小 質(zhì)粒：質(zhì)粒：10k

31、b 噬菌體：噬菌體：23kb 黏粒：黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程?細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformationtransformation） ：p163p163感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells） ：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2等化等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源化，能容許有外源DNA的載體分子通過，處于的載體分子通過，處于這種狀態(tài)下的細(xì)胞稱這種狀

32、態(tài)下的細(xì)胞稱將異源將異源DNADNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀獲得新的遺傳性狀供體供體 受體受體轉(zhuǎn)導(dǎo)？轉(zhuǎn)導(dǎo)？ 轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)染？ 常用的轉(zhuǎn)化方法：常用的轉(zhuǎn)化方法： 化學(xué)轉(zhuǎn)化（化學(xué)轉(zhuǎn)化（CaCl2）法）法 電擊法電擊法 PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 人工體外包裝人工體外包裝 化學(xué)轉(zhuǎn)化原理：化學(xué)轉(zhuǎn)化原理： 在在0冷凍處理時(shí)，處于冷凍處理時(shí)，處于CaCl 2低滲溶液中的大腸桿低滲溶液中的大腸桿 菌細(xì)胞膨脹成球形。菌細(xì)胞膨脹成球形。DNA可吸附于其表面。在短暫的可吸附于其表面。在短暫的 熱沖擊下，細(xì)胞吸收外源熱沖擊下，細(xì)胞吸收外源DNA ，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi)，然后

33、在豐富培養(yǎng)基內(nèi) 復(fù)原并增殖，表達(dá)外源基因。復(fù)原并增殖，表達(dá)外源基因。電擊轉(zhuǎn)化：電擊轉(zhuǎn)化：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。菌液：生長對數(shù)期菌液：生長對數(shù)期場強(qiáng)場強(qiáng)(最大轉(zhuǎn)化效率最大轉(zhuǎn)化效率)：12.5-15kV/cm 溫度：溫度：0-4 克隆的篩選：克隆的篩選： 抗生素基因?？股鼗颉?常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等素、四環(huán)素、鏈霉素等 -互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選 電泳檢測法電泳檢測法

34、 營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）pBR322AmpTet -互補(bǔ)篩選互補(bǔ)篩選 質(zhì)粒質(zhì)粒: -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列）的調(diào)控序列和氨基端（和氨基端（N端）端）146個(gè)氨基酸編碼序列個(gè)氨基酸編碼序列 宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞: 編碼編碼-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）部端）部分序列分序列 添加添加 IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上篩選藍(lán)白斑的培養(yǎng)基上篩選藍(lán)白斑藍(lán)白斑篩選 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色）（白色） （藍(lán)色）（藍(lán)色） Lac Z（失活）（失活） , IPTG X-gal X-gal （白色）（白色） （白色）（

35、白色）藍(lán)白斑藍(lán)白斑例1. General process of gene engineering1. 1. 從生物有機(jī)體基因組中，分離從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的出帶有目的基因的DNADNA片段。片段。2. 2. 將帶有目的基因的外源將帶有目的基因的外源DNADNA片段片段和載體分別進(jìn)行酶切。和載體分別進(jìn)行酶切。4. 4. 將重組將重組DNADNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。5. 5. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組得了重組DNADNA分子的受體細(xì)胞，并篩

36、選出分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。3.3.將酶切片段與具有選擇記號(hào)的載將酶切片段與具有選擇記號(hào)的載體連接，形成重組體連接，形成重組DNADNA分子。分子。+5.1 重組重組DNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用5.5 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù)5.6 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.2 DNA基本基本操作技術(shù)操作技術(shù) 5.2.1 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyac

37、rylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，如：許多分子生物學(xué)研究方法，如： DNA分型、分型、DNA核核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，受到科學(xué)界的高度重視。重視。 一種分子被放置到電場中，它就

38、會(huì)以一定的速度移向一種分子被放置到電場中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的速度，叫做電泳的遷移率遷移率，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本，它與電場強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說，電場強(qiáng)度越大，身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說，電場強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)，反之則較慢。由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故定的支持

39、介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。 已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。分子混合物中的各種成分彼此分離開來?；驹砘驹?在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖在生理?xiàng)l件下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是呈離子化狀磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，是

40、呈離子化狀態(tài)的，所以，態(tài)的，所以，DNA和和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），），把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。由于把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。由于糖糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子分子的這種遷移速度，

41、亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。本身的大小和構(gòu)型。大分子量的大分子量的DNA移動(dòng)的慢移動(dòng)的慢小分子量的小分子量的DNA移動(dòng)的快移動(dòng)的快電泳緩沖液電泳緩沖液陽極陽極陰極陰極DNA加樣孔加樣孔DNA Marker及其作用及其作用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為片段的范圍為0.250kb之間之間聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1個(gè)堿基對到個(gè)堿基對到1000個(gè)堿基對之間個(gè)堿基對之間凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度分離分離DNA片段的大小范圍（片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖瓊脂糖50 000

42、1 0000.7%瓊脂糖瓊脂糖20 0001 0001.4%瓊脂糖瓊脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱?？紫毒驮龃?，其分辨能力也就隨之減弱。 在凝膠電泳中，加入適在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（量溴

43、化乙錠（ethidium ethidium bromidebromide，簡稱，簡稱EtBrEtBr）染料對核酸分子進(jìn)行染染料對核酸分子進(jìn)行染色，然后將電泳標(biāo)本放色，然后將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，可置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中出凝膠介質(zhì)中DNADNA的譜的譜帶部位，即使每條帶部位，即使每條DNADNA帶中僅含有帶中僅含有0.050.05g g的的微量微量DNADNA，也可以被清，也可以被清晰地檢測出來。晰地檢測出來。在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光分子發(fā)出熒光稱樣稱樣溶解溶解加熱加熱制板制板倒膠倒膠電

44、泳操作基本程序電泳操作基本程序取樣取樣點(diǎn)樣點(diǎn)樣電泳電泳檢測檢測結(jié)果結(jié)果5.2.35.2.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法序列的方法。PCR最初的原始雛形概念是類似最初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制基因修復(fù)復(fù)制，它，它是于是于1971年由年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純提出。他發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類似且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。前兩個(gè)周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)

45、展出來的而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于則于1983年由年由 Dr. Kary B. Mullis提出，并于提出，并于1985年與年與 Saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。此后，關(guān)的論文。此后，PCR技術(shù)在生物科學(xué)研究和應(yīng)用中得以廣技術(shù)在生物科學(xué)研究和應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的最重要技術(shù)。Mullis也因此也因此獲得了獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1.變性變性（90-96） 在加熱或堿性條件下可使在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。，稱

46、之為變性。2.退火退火（25-65） 是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段是模板與引物的復(fù)性。引物是與模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNA片段。片段。3.延伸延伸（70-75） 從結(jié)合在特定從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按以堿基配對形式按53的方向沿著模板順序合成新的的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。鏈。標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：過程分為三步： PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 引物引物 dNTPdNTP MgMg2+2+ TaqTaq聚合酶聚合酶 模板模板 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液u引物設(shè)計(jì)的基本原則：引

47、物設(shè)計(jì)的基本原則：1.引物的長度一般為引物的長度一般為15-30 bp，常用的是，常用的是18-27 bp，但不，但不應(yīng)大于應(yīng)大于38bp，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其退火溫度大于，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其退火溫度大于74，不，不適于適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2.引物序列引物序列3端出現(xiàn)端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。 3.引物引物3端的末位堿基對端的末位堿基對Taq酶的酶的DNA合成效率有較大的影合成效率有較大的影響。末位堿基為響。末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此個(gè)堿基

48、，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基端使用堿基A。另外，兩條引物。另外，兩條引物3端若端若互補(bǔ)，或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致互補(bǔ)，或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反反應(yīng)失敗。應(yīng)失敗。4.5端序列對端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合或標(biāo)記物?？稍谝镌O(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等熒光素、地高辛等. 通常應(yīng)在通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加端限制酶位

49、點(diǎn)外再加1-2個(gè)個(gè)保護(hù)堿基。保護(hù)堿基。5.引物序列的引物序列的GC含量一般為含量一般為40-60%，過高或過低都不利，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)，因?yàn)橛谝l(fā)反應(yīng)，因?yàn)镚C含量決定了含量決定了DNA雙鏈的解鏈溫度雙鏈的解鏈溫度（Tm）。另外，上下游引物的）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。 6.一般一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。過低則降低產(chǎn)量。用用NaOH 將將pH調(diào)至調(diào)至7.0。 dNTP原液可配成原液可配成5-10mmol/

50、L并分裝并分裝, -20貯存。一般反應(yīng)中每種貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為的終濃度為20-200mol/L。 理論上理論上4 種種 dNTP各各20mol/L, 足以在足以在100l反應(yīng)中合成反應(yīng)中合成2.6g的的DNA。當(dāng)。當(dāng)dNTP終濃度大于終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的聚合酶的活性。活性。4種種dNTP的濃度應(yīng)該相等的濃度應(yīng)該相等, 以減少合成中由于某種以減少合成中由于某種dNTP的不足的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。 udNTPdNTPuPCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系- Mg- Mg2+2+Mg 2+濃度對濃度對Taq DNA聚合酶影響很大

51、聚合酶影響很大, 它可影響酶的活性和真實(shí)性它可影響酶的活性和真實(shí)性, Mg 2+濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性濃度過低，會(huì)顯著降低酶活性; Mg 2+濃度過高又使酶催化非濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。 Mg 2+濃度還影響引物退火和解鏈溫度以及引物二聚體的形成等。濃度還影響引物退火和解鏈溫度以及引物二聚體的形成等。通常通常Mg 2+ 濃度范圍為濃度范圍為0.5-2mmol/L, 1.5mM最佳。最佳。uPCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系- Taq- Taq聚合酶聚合酶擴(kuò)增效率最高擴(kuò)增效率最高, 1000 bp/min 活性活性5-3 DNA聚合酶活性強(qiáng)聚合酶活性強(qiáng)無無3-5 DNA

52、外切酶活性外切酶活性, 錯(cuò)配率每個(gè)循環(huán)約錯(cuò)配率每個(gè)循環(huán)約1/6000 3末端加末端加“A” , 產(chǎn)物可直接進(jìn)行產(chǎn)物可直接進(jìn)行“TA”克隆克隆pfu酶酶保真度高保真度高原理原理: 具具35核酸外切酶活性，即校正功能。核酸外切酶活性，即校正功能。效率相對較低效率相對較低, 500 bp/min 3末端不加末端不加“A”，加，加A后才可進(jìn)行后才可進(jìn)行TA克隆。克隆。就模板就模板DNA而言而言, 影響影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應(yīng)中的模板濃度為一般反應(yīng)中的模板濃度為 50-100 ng/ml。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。模板量過多則可能增加非特異性

53、產(chǎn)物。 DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影中的雜質(zhì)也會(huì)影響響PCR的效率的效率.uPCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系- -模板模板DNADNAuPCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 PCR PCR反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液緩沖液一般含緩沖液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的和適當(dāng)濃度的Mg 2+ . 另外，反應(yīng)液可加入另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇的二硫蘇糖醇(DDT)或或100g/ml的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性。它們可穩(wěn)定酶活性。在第一輪循環(huán)前在第一輪循環(huán)前,在在94下變性下變性3-5min非常重要，它

54、可使模板非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全，往往使完全解鏈。變性不完全，往往使PCR失敗，因?yàn)槲醋冃允?，因?yàn)槲醋冃酝耆耐耆?DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量。產(chǎn)量。對于富含對于富含GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、引引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實(shí)際使用物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實(shí)際使用的退火溫度

55、比擴(kuò)增引物的的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低值約低5，時(shí)間一般為，時(shí)間一般為20-60s。延伸反應(yīng)通常為延伸反應(yīng)通常為72，接近于，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫聚合酶的最適反應(yīng)溫度度75。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)?。?shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從聚合酶的作用溫度范圍可從20-85。 一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間(5-10 min)的的延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)。以獲得盡可能完整的產(chǎn)物以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進(jìn)行克隆或，這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。測序反應(yīng)尤為重要。當(dāng)其

56、它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般濃度。一般而言而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會(huì)使PCR產(chǎn)物中產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。非特異性產(chǎn)物大量增加。 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠， 需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)倍作為模板，重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)行擴(kuò)增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，輪循環(huán)后， 擴(kuò)增水平可達(dá)擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010 。PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序:PCR技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)

57、用技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用 （1）目的基因的直接克隆，）目的基因的直接克隆， （2）通過）通過RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行cDNA的克?。坏目寺。?（3）制備）制備DNA探針，進(jìn)行分子檢測等。探針，進(jìn)行分子檢測等。 5.2.4. 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR 一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。只有在熒熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定

58、量分析。之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)中的一些重要因素：技術(shù)中的一些重要因素： Ct值。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。值。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 Ct值與起始模板的關(guān)系，每個(gè)模板的值與起始模板的關(guān)系，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛?jì)算出值越小?？衫脕碛?jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。該樣品的起始拷貝數(shù)。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR中熒光化學(xué)，熒光定量中熒光化學(xué)，熒光定

59、量pcr所使用的熒光所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：如下： TaqMan熒光探針熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基

60、外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。產(chǎn)物形成完全同步。 SYBR熒光染料熒光染料：在：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光熒光染料，染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺霟晒馊玖咸禺愋缘負(fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與號(hào)，