快速診斷技術(shù)

1、快速診斷技術(shù). y# y5 y% H8 5 y) ( Y主要內(nèi)容：  D, F/ ! 2 G(   P. 5 # E1免疫膠體金基本原理3 B7 0 h# B( D1 X) L1 2膠體金制備方法及標(biāo)記技術(shù)分類' ?- 4 k! j4 b3膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟0 g, r0 j  n* Z* ( F4膠體金制備注意事項(xiàng)及應(yīng)用1 C6 S  E+ l3 y3 5膠體金標(biāo)記技術(shù). X% C; O6 $ R/ i& F# F# T6制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應(yīng)用技巧7 C2 E: a9 d1 r+

2、A1 3 q, p7免疫熒光技術(shù)基本原理8 e* Z1 D6 G6 _: k2 l8免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法及分類6 P, t9 M1 i6 z' t; i9免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟7 A& . i" Z- e% a10免疫熒光常見(jiàn)問(wèn)題, u! M/ " I- g7 V3 H- m# y! Q11細(xì)胞因子檢測(cè)原理+ S! H9 1 d:   n$ n12細(xì)胞因子檢測(cè)方法分類- c$ o8 M/ l3 q9 o13細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用+ Z) X0 _/ ; T0 v; b9 h3 V14ELISPOT技術(shù)原理: S) Y- M. p  

3、;/ V/ Z* G3 w; " T15ELISPOT技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟4 d& T' 8 i( x7 E$ ' L16ELISPOT技術(shù)優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用' U8 F5 Q9 I9 T; B& U" _0 h4 w4 i  U7 j, s聲明：% M8 M' |8 ( r( j& 1、本篇涉及的資源主要源于網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)書籍，由酷友搜集、分析、整理、審改，供大家學(xué)習(xí)參考用，如有轉(zhuǎn)載、傳播請(qǐng)注明源于基因酷及本篇的工作人員；若本篇侵犯了您的版權(quán)或有任何不妥，請(qǐng)Email genecool告知。0 E% Y) , L;

4、E0 P0 _2、由于我們的學(xué)識(shí)、經(jīng)驗(yàn)有限，本篇難免會(huì)存在一些錯(cuò)誤及缺陷，敬請(qǐng)不吝賜教：請(qǐng)到基因酷論壇（ genecool。6 ?7 R$ |" / j( w) 致謝：( P3 d& n" v. R$ y4 G整理者：microfox          審改者：wny+ I4 5 , I2 v; x# p/ & |. s7 t5 J! b! P主要參考資料：9 J* N2 T$ U) ; x8 V現(xiàn)代臨床免疫學(xué) 趙武述  J0 2 f) D* U- E" b# w, t

5、1 G免疫膠體金技術(shù)基本原理及其在疾病檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展  李忠秋 馬紅 郭鎮(zhèn)華 吳賽輝 劉娣- j. Q3 _/ w+ i4 M; F免疫熒光基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)新原理及其臨床 德）斯托爾希（Storch，W.B.）主編，阮幼冰 主譯( z% I  I! a9 H細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展  李梅 宋達(dá)琳 康維強(qiáng)0 R: " d0 w3 a) k8 t0 A6 快速診斷之免疫膠體金基本原理免疫膠體金基本原理& j& ) Y; P# ?# a1 D& K2 A' O5 V; T* z& Q' R2

6、 9 k% K       膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能例用到。' 1 L( ?) s. |# Z0 N3 J       1971年Faulk 和Taytor將膠體金引入免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法(

7、 immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測(cè) HBsAg、HCG 和抗雙鏈抗體等，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。 * r/ N) N' h& x免疫膠體金技術(shù)的基本原理3 L/ M: q1 _, d; t% J$ W" k       膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成

8、為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。; " / - p* % m% m       膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。2 u4 e! Q# E, $ a4 I4 S      

9、 膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。 7 & b3 p8 w2 w  b# O       免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling tech

10、ique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。8 h0 W1 D0 N, e0 S/ Y5 P' c: G. a常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù) * U" J2 D- |- G（1）免疫膠體金光鏡染色法 ' E4 s) q, f' s4        細(xì)胞懸液涂片或組織切片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記

11、的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記，使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。 # 8 I4 . w9 n( S$ l免疫膠體金電鏡染色法 1 L"   U: L% o  i       可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合，然后進(jìn)行負(fù)染。可用于病毒形態(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。 ' $ b) D- B, ?（2）斑點(diǎn)免疫金滲濾法 - e8 c! & N8 % m( f       應(yīng)用微孔濾膜（如膜）作載體，

12、先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體。 & a/ W$ e. C* B5 W（3）膠體金免疫層析法 - W) ' 5 x6 u- E7 w"        將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已

13、發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。+ c7 D4 S+ 2 Y& 膠體金制備方法及標(biāo)記技術(shù)分類膠體金制備方法2 , d) b3 + t3 e( x; 4 |       膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)不同的還原劑可以制備大小不同的膠體金顆粒。常用來(lái)制備膠體金顆粒的方法如下。5 S. p8 b  ?% k, w' r（1）枸櫞酸三鈉還原法1 Y! |5 O- e# 2 D- s4 f( U' D( z      

14、1）10nm膠體金粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液3ml，加熱煮沸30min，冷卻至4，溶液呈紅色。6 z, J! ?! t& B# t       2）15nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加入1枸櫞酸三鈉水溶液2ml，加熱煮沸15min30min，直至顏色變紅。冷卻后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml，混勻即可。/ O1 I- c& r' k& a$ x" T0 m&        3）

15、15nm、18nm20nm、30nm或50nm膠體金顆粒的制備：取0.01HAuCl4水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1枸櫞酸三鈉水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒則分別為15nm、1820nm、30nm和50nm。6 f3 v4 v: F2 b+ B* 6 X2 X（2）鞣酸枸櫞酸鈉還原法+ R9 E8 W5 ) M1 z6 % w1 t       A液：1HAuCl4水溶液1ml加入79ml雙餾水中混勻。" E* r% 7 v5 M7 S% 1 f 

16、     B液：1枸櫞酸三鈉4ml，1鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K2CO3液0.2ml，混合，加入雙餾水至20ml。0 v' Z/ O' q3 V: Q       將A液、B液分別加熱至60，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍(lán)，繼續(xù)加熱攪拌至溶液變成亮紅色。此法制得的金顆粒的直徑為5nm。如需要制備其它直徑的金顆粒，則按表15-1所列的數(shù)字調(diào)整鞣酸及K2CO3的用量。# v8 X, w* N- |/ b8 e6 J       表1鞣酸枸櫞酸鈉還原法試

17、劑配制表% g" k4 9 |' V# Z; K/ H# ?4 K1 Z8 l  J% L$ 5 O+ f金粒直徑/ R' q! g/ K+ h" E& k# y( Y) |（nm）+   3 u! u# R1 - b& ; P9 J% A液% u) V( V' ?# R1 tB液. c2 d' N7 ! K  K2 N1 t+ r. . c5 p1HAuCl4  8 K7 w9 C0 8 O雙餾水1 I( 3 S4 M+ f9 U& w*

18、 q1枸櫞酸三鈉$ N: e2 g! J& R7 p' F3 & S1 o0.1Mol/L5 V$ l8 F' . 9 v" UK2CO36 T1 m( / c' " 1鞣酸- |9 M6 t8 D7 E+ e, d; U% A雙餾水( q0 p1 U& q# C8 A! M! j; 54 ?/ A2 o: p. & F" ( M7 z: g1( x0 y$ K7 k% W. 7 Q  |( l% _0 79& b4 N% D!   e46 I. c&

19、1 |4 1 D0.20+ c4 o$ |) f' o: W' ' A6 W0.70: O-   a$ A; b( W4 15.10& j7 a! c! 5 G3 10! |# n* ' y% n2 1 Y3 b1' e4 S3 |7 l3 0 _& D797 q% ?  k+ o0 ?5 L1 L- ' s' V' Z4, X$ h2 q* $ q/ q% 0.0259 s- g'   * k/ e6 F0.10% E6 O! W/ K7 A(

20、W: A15.875. F. , t" n: / l( I+ a0 w152 _$ d) ( g$ 7 & P$ _* % W; 14 M9 y) z9 I, X3 y9 Y79' 7 c" ?' S( c3 Y) / X0 m7 y43 b7 c' j0 D( : D0.00256 T, m# $ d# 1 x0.01) w8 H0 ) J6 u. h4 S! 7 |15.9875* ( V" G- . L! V/ t9 y+ * e0 a& . C& G+ f* 7 w（3）檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠： % m(

21、 ! D! _$ z7 2 j7 ?6 * w9        取0.01氯金酸水溶液100ml 加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入檸檬酸三鈉水溶液 0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見(jiàn)光區(qū)最高吸收峰在535nm，1cm / 535 = 1.12 。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯著的顏色變化，這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。2 g  S( G+ a3 Q, a* i&

22、 F6 f       金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他條件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒徑的金溶膠，見(jiàn)附表。 8 x, E( q4 d8 F附表 100 ml 氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對(duì)金溶膠粒徑的影響' N2 q2 d6 T0 h% * W6 n# L       檸檬酸三鈉ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00: X% 4 % K9 5 + O       金溶膠顏

23、色 藍(lán)灰 紫灰 紫紅 紅  橙紅 橙$ 0 G3 C" W1 m1 c  s       吸收峰(nm)  220  240  535 525  522  518, t* ! , h% o( B2 w       徑粒(nm)    147  97.5  71.5 41  24.5

24、0; 15% Q5 s1 D& I. v! j1 j（4）檸檬酸三鈉鞣酸混合還原劑：  t) g5 M$ p  Q/ l$ " R  y( Y       用此混合還原劑可以得到比較滿意的金溶膠，操作方法如下：取 4ml檸檬酸三鈉 (Na3C6H5O7.2H2O)，加入05ml鞣酸，05ml 25mmo/L K2CO3（體積與鞣酸加入量相等），以雙蒸餾水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60取1ml的 HAuCl4，加于79ml雙蒸餾水中，水浴加熱至60，然后迅速將上

25、述檸檬酸鞣酸溶液加入，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.51小時(shí))后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰5分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。# i* _- T  u4 Q% Y& z(5）白磷還原法：7 _' 9 w" S0 Z+ N       在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫放置15分鐘，在回流下煮沸 直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑約 6nm，并有很好的均勻

26、度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)驗(yàn)室不宜采用。5 F" c0 c* M9 U* A8 t       要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級(jí)后制得膠體金顆粒直徑的變異系數(shù)（）可小于。* u# s: f0 w0 _膠體金標(biāo)記技術(shù)路線的選擇8 u& F5 G& w/ m8 l       (1)包埋劑 根據(jù)抗原或標(biāo)記底物性質(zhì)決定包埋劑種類。7 S0 Z# f/ f7 G. O       蛋白類，推薦使用K4M；包埋后立即切

27、片標(biāo)記。5 v2 W( S; U' v) X! m       外泌蛋白可選擇spurr?？砷L(zhǎng)期保存使用。! J. P, I  O6 F! D8 , z8 U7 S       細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分，如纖維素、b-1,3-葡聚糖、幾丁質(zhì)、多酚化合物等，可選擇spurr。5 l' t! K# m, w+ r# t' D9 l2 P(2)膠體金體積6 Z7 X5 9 N; H! z       精細(xì)定位如病毒、細(xì)胞器定位等選用5 nm膠體金。!

28、 D8 $ j' i& k       細(xì)胞壁組分采用15-20 nm膠體金。/ G% D4 D7 o  w" P# _/ D       多標(biāo)記時(shí)，膠體金直徑推薦選用6 nm、10 nm、15 nm；$ n: V- _9 r* V' p! s7 a- ) Y       穩(wěn)定抗原采用較大顆粒膠體金。一般蛋白標(biāo)記采用10 nm。$ r+ y* B: a( 7 v(3)通用探針選擇&   H9 S

29、/ ?,        IgG-gold：-20°C可保存1年；但定位時(shí)膠體金距離標(biāo)記位點(diǎn)較遠(yuǎn)，不適于精細(xì)定位。. j4 S0 g5 t& X8 I6 I       Protein A/G：-20°C可保存3個(gè)月；但定位時(shí)膠體金距離標(biāo)記位點(diǎn)較近，適于精細(xì)定位和多標(biāo)記。2 ?2 ( m) z% E: U% f2 Q, c       Protein A和Protein G與不同抗體之間的親和性3 L' l" R7 V+ Z6 H&

30、#39; ?* P; _9 p$ 抗體來(lái)源2 g3 Q! h- ( W$ d) R" IIgG類型. k* A8 R3 U. s& u2 v' B! S與Protein A的親和性0 i, C3 S' b; r7 Z與Protein G的親和性* ?9 R! |3 W& i1 人9 I! A9 q  I' F  pIgG(正常)0 K6 X, o( A" q+: s6 X/ 6 n' 1 P# H* S, q7 V2 B+% i$ w5 B, h/ oIgG12 H) n* . s4 k

31、; p+. 6 |: m4 X. . k( T& +* N& s: k- w7 D& c; 6 IgG2! + O/ L2 U9 x& l  j+ i+% m6 j# E- o% I' l. h+4 * D  c; A. S6 t  V! F$ r3 v7 VIgG31 Q  H: k7 B% p. m! 6 , z' i: |& e7 S' d( G+' q1 l) c. ! M2 H% Y  r: oIgG4- z$ I

32、: r: j, Z, 8 % i5 T7 O$ D+5 S2 ?( 3 K) q. R& Y5 A+  t0 a/ M3 s. l* j; ) N小鼠(mouse)6 i" g) X8 d" S8 y$ X. E4 C' G$ qIgG1: & h7 f; |4 E+  S! q3 J( x$ Z- z$ _& +4   W1 v0 Q  " n. g% IgG2a8 5 H. e; R$ +/ m. ?) P" N5 l' ?- q+

33、3 h9 N0 k2 e" t- U0 j' |IgG2b- m. E6 L& ; +/ s" X  5 T3 5 l! +' Z  P3 _9 " o  ?! ?0 SIgG3* s! k# ) m$ t5 a4 c6 / x+; v. w) c# * |# N0 G% T1 g( C3 j+( j# A4 I% 2 D0 r* S% K大鼠(rat)0 k& P" f& U/ 7 k$ $ XIgG1: M- N  0 x9 y$

34、u& k2 L: i2 a  U4 W# J# W& t. z8 ( J" G: M+/ , n5 N9 f  D* IgG2a; 8 A. f6 S) 7 j4 O* ' n% O( ; S2 H: S4 e+( E2 T' U4 x. e% lIgG2b8 e" R2 Q+ v0 y0 ( L3 j6 P9 h0 6 p( z& j- x+ m& r8 T+4 f& s0 z$ v+ l  t6 sIgG2c' ?& W4 g$ q. 3

35、x3 ?+. C. s3 M* C! Q& q+: r( a4 W/ k. i! V" k1 o山羊(goat)& V' Z( x: l* Y4 hIgG+ C, $ i% 3 z& R% x: H+ T( q, A& z  A7 D) F, I0 O& w2 % u+7 C3 N' R: L. v" S$ x: ) I8 R綿羊(sheep)7 f- N: s8 z% S% h. 0 X, wIgG9 J* q/ e* h( C2 P# _9 |0 e+' j9 S2  

36、0;q: c6 # M+8 F/ 1 ) K' D家兔, x; r$ B( ! ' B3 x  x# CIgG# t: o+ 1 m- B! f! P8 2 % W# J7 n2 M# H+( - K' ' v- * u# t, w+" K$ R; d. x0 O& i狗3 t! h' V5 K/ d$ ! , RIgG# F5 J* e) r. Z8 o) + C- i! B+/ Y1 V5 ! X6 # Q& P+2 u. A* ' " M4 V. v豬+ " m6 u. i-

37、 8 E% K7 Q' f& mIgG, T+ x; P( B3 J& q& N+( o& S9 o5 G1 : ?" f+' Z9 o4 M, D- ?# E. i' z2 ; $ K雞5 I! z* E; N( f# ?& sIgG1 M; 7 L' T6 N6 p( . E  N# 1 d) ?5 z# d9 k; g" I+/ E' o" h. q1 y8 n5 b馬) y/ z. G3 W  T% Y/ F& IgG 

38、 V7 F# J) w; B  Z+, h. R: N. T: E) V) G+- C+ z% * P0 k9 X豚鼠(guinea-pig)  N* Q/ V  r( mIgG+ 4 % " 3 k& z: 0 N: g+& F' P1 Q/ Y( b& - f& + u, h- w9 P1 l' R# i倉(cāng)鼠(hamster) _' n& m: 1 D4 SIgG6 V: & N% m# |+" w, b3 R1 ! Q+. I+

39、 " J: J. y* Z. j4 n貓; v+ f6 R- S# s5 3 EIgG2 o' F- A, ?! B; p  T3 O7 B! Y+- f2 / I1 ) Y: ?7 ?; R* R5 C  I2 U/ L& N5 I) o; f/ r小牛' M' j  r1 K3 s4 Q  i2 r  l# IIgG  p0 i( M; L' r% . S+" x- o: C: - a: s: l( G+'

40、; m' P& J2 v! m9 J+ K( j快速診斷之膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟/ s. " b/ t0 g' O- b/ r6 9 q3 ) 0 L7 y4 _（1）蛋白質(zhì)的處理：膠體金標(biāo)記蛋白的制備  # - b# T: h' Q3 L* a# U, J7 j5 c膠體金對(duì)蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。! S0 G

41、7 E- u4 S" q; S! _7 V1）待標(biāo)記蛋白溶液的制備  將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過(guò)夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。8 w/ O7 F$ 1 l6 m! r2 c. K2）待標(biāo)膠體金溶液的準(zhǔn)備  以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標(biāo)記IgG時(shí)，調(diào)至9.0；標(biāo)記McAb時(shí),調(diào)至8.2；標(biāo)記親和層析抗體時(shí)，調(diào)至7.6；標(biāo)記SPA時(shí)，調(diào)至5.96.2；標(biāo)記ConA時(shí)，調(diào)至8.0；標(biāo)記親和素時(shí)，調(diào)至910。8 b,

42、B" T1 h! _- k- S% o5 h由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。! y& n5 G5 A5 x0 P由于鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄清無(wú)細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。 9 4 o9 ( S: / % e2 J6 N4 q一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。( X, a5 s. W9 f% G8 D, （2）蛋白質(zhì)最適用量的選擇：膠體金與標(biāo)記蛋白用量之比的

43、確定! z3 W( r0 T2 ?: f: a7 C2 L6 h1）根據(jù)待標(biāo)記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。2 _( h3 |- F! Z. i1 E5 p2）將標(biāo)記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對(duì)照管只加1ml稀釋液。) Y7 S8 x, U2 A. r3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。& h* J8 d6 d, W, V4）結(jié)果觀察，對(duì)照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的

44、量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加1020。& l# Y: a) W: t4 o將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質(zhì)540ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照管，分鐘后加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10即為最佳標(biāo)記蛋白量。4 w% J  p) T# d( d（3）標(biāo)記：膠體金

45、與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合  : % R. g1 ! j. 6 B8 B將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5BSA使溶液終濃度為1；1聚乙二醇加至總?cè)芤旱?10。% E6 ?# q+ W( k% V" 在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。6 K" s% t6 t& J1

46、 ( O6 z4 z7 d下述標(biāo)記步驟最為常見(jiàn)： 1 n) N# C+ h" / y4 p用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH(標(biāo)記時(shí)調(diào)到pH6.0)。: _$ ( H" S' T3 y& q: i8 F于100ml 金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為ml），攪拌分鐘。. N/ M6 I1 i* L. E0 / M6 C  a; G; c加入5mlPEG20000溶液。; W% G, W) g8 o% l/ G于10000100000g離心3060分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件），小心吸

47、去上清液（切忌傾倒）。! Q( - S2 B8 將沉淀懸浮于一定體積含0.20.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以 1cm/540nm=1.5左右為宜，以 0.5mg/ml疊氮鈉防腐，置4保存。  W: 3 R/ D9 S2 B  w包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以含 0.1的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2，以蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。$ |$ h3 r  r9 c% n2 j: 以上操作中應(yīng)注意，一切溶液

48、中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處理。- A, _3 V6 |+   ! G, J6 h8 p* M（4）膠體金標(biāo)記蛋白的純化$ o- T; V* j% q8 G5 t% E& e) _1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。) 7 l4 S5 - 7 E, D用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4離心1h；20nm40nm膠體金結(jié)合物，14

49、 000g，4離心1h。仔細(xì)吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），將沉淀重懸為原體積的110，4保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50甘油可貯存于-18保存一年以上。/ q" 9 M1 E3 Q4 2 r3 A, B0 L為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進(jìn)一步用1030蔗糖或甘油進(jìn)行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。! U% o) E: s5 J& K5 I2）凝膠過(guò)濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的15110。再經(jīng)1 500r/min離心20

50、min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的110，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1BSA，0.05NaN3，pH8.2者用IgG標(biāo)記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時(shí)略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標(biāo)記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過(guò)濾除菌、分裝,4保存。最終可得到7080的產(chǎn)量。( F1 $ C8 q3 N8 W" n(

51、9 W+ W% L3 g* B+ d7 7 Y膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定- 4 q3 H5 n9 L2 C3 O+ |+ r0 S5 m3 h（1）膠體金顆粒平均直徑的測(cè)量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標(biāo)蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察?；蛴么姿徕檹?fù)染后觀察。計(jì)算100個(gè)金顆粒的平均直徑。! 3 P- u3 a! B8 r* & Z（2）膠體金溶液的OD520nm值測(cè)定：膠體金顆粒在波長(zhǎng)510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）將膠體金蛋白試劑作120稀釋，OD5200.25左右。一般應(yīng)用液的OD52

52、0應(yīng)為0.20.4。- R, P  k0 D$ k/ W  k* f2 p% V（3）金標(biāo)記蛋白的特異性與敏感性測(cè)定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標(biāo)記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的抗原或抗體，對(duì)金標(biāo)記蛋白的特異性和敏感性進(jìn)行鑒定。9 t9 a* E8 J' G; g$ W9 P快速診斷之膠體金制備注意事項(xiàng)及應(yīng)用 i7&   v+ p, V- K( Y+ Z$ 膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存. _5 w

53、- % |+ R2 B0 ' D膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可放置數(shù)年不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解質(zhì)等。 ; g" |$ Z- W) B- C1 h$ h/ 8 n2 I金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過(guò)高。高濃度親水性非電解質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的穩(wěn)定效果。: x# m. F; A$ Y. - s2 當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取

54、決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過(guò)氧化物酶等，當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定，提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶液可用0.20.5mg/ml PEG20000 作為穩(wěn)定劑。在410貯存數(shù)月有效，不宜冰凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。5 R4 S* I' Z- j7 n- " n4 v" r: d$ f' G2 z* l8 J制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)" t3 O  L7 ( X（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過(guò)硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖

55、洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。0 k$ r; V5 H& t9 w（2）試劑、水質(zhì)和環(huán)境：劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45µm）過(guò)濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。氯金酸極易吸潮，對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其水溶液在可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。: B: _# b. 0 w+ P金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH

56、電極測(cè)定金溶液的pH值。為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸檬酸磷酸鹽(pH35.8)、Tris-HCL (pH5.88.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.510.3)等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過(guò)高而使金溶膠自凝。& T1 o7 G: _2 y- x（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。& v/ x3 u7 T( r) B（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。/ ?0 y% K8 ; w/ J5 W* o. O" A（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整個(gè)小包

57、裝一次性溶解。/ G+ k- 3 r% D+ t# A: V+ b- 5 n' P$ i( l( I' Q膠體金技術(shù)的應(yīng)用3 G8 H" t: u' s1免疫學(xué)中的應(yīng)用4 p: g3 T* U3 w1 5 Q6 K6 w# （1）膠體金在電鏡水平的應(yīng)用% k2 z& O+ x# Y* p3 膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)應(yīng)用不同大小的顆?；蚪Y(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為315nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。315nm 的膠體金多用于單一抗原顆粒的檢測(cè)，而直徑15nm 多用于檢測(cè)量較多的感染細(xì)胞。( y

58、+ R% v- w3 m- D0 u膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：. i9 T6 Q; d' c9 i. S) w 細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。! D' a. a7 m$ _0 t1 | 單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)。; , W: h. T9 m 組織抗原的檢測(cè)。. ' Y  / U6 X6 ?" H, o0 ) F金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。 & x* k$ _) y: : U4 M( Y1 8 j實(shí)驗(yàn)證明，該法樣本用量少、檢測(cè)速度快、對(duì)比明

59、顯、操作簡(jiǎn)單、敏感性和特異性高，既可用于抗原檢測(cè)，也可用于抗體檢測(cè)，因此，可同時(shí)適用于科研和診斷。) l: y# B1 z+ D: & r) D7 O（2）膠體金在光鏡水平的應(yīng)用: S4 _" u3 3 t* N  m膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：- X& ?. P* O7 g! A% |( c8 G 用單克窿抗體或抗血清檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng)的單層細(xì)胞的膜表面抗原。* H& ?* 0 ?0 S$ N, j 檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，0 s9 j8 y0 b3 U9 c 組織中

60、或亞薄切片中抗原的檢測(cè)。 & p' s1 T: O6 C# d" V+ O" o膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過(guò)高和內(nèi)部酶活性干擾等缺點(diǎn)。   _) J. z7 U* q) I& V（3）膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用：, / M, Y, v6 t5 E應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué)研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記困難，因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。這樣可以同時(shí)進(jìn)行幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯

61、地改變紅激光散射角，因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。% D3 W4 L- N$ a! i（4）凝集試驗(yàn)：?jiǎn)畏稚⒌拿庖呓鹑苣z呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會(huì)沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無(wú)色，這一原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。+ M% y* g/ : z- 5 v（5）免疫印跡技術(shù)(immunoblotting)：免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用酶免疫法（或免疫熒光、）進(jìn)行定量。( * P1 S: U3 X! X(

62、  _免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測(cè)知樣品中的特異性抗原。 , Q- Q1 ?: d" w/ t) Z; k+ M利用金顆?？纱呋y離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見(jiàn)性，更可大大提高測(cè)定靈敏度，檢測(cè)下限可低至 0.1ng，這種免疫金銀染色法應(yīng)用已日趨廣泛。1 . k5 A8 x7 k1 a6 K由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫診斷上有很大的應(yīng)用潛力。: " o# _2 o

63、9 E0 ( N& ; g7 Y（6）膠體金在肉眼水平的應(yīng)用5 4 I$ ?+ s( L0 E% u膠體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物，用于肉眼水平的免疫檢測(cè)中。除了膠體金本身具有的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：5 z2 Y" A$ w3 l/ 9 s試劑和樣本用量極小，樣本量可低至12ul；6 N( " # C4 d" z  T5 不需計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用； ) d, * k# F" r沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；" B" g9 j+ + G實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存；4 f

64、' T- h( v4 : y時(shí)間大大縮短，提高了檢測(cè)速度。# j2 L/ Z3 D( A金標(biāo)過(guò)程中，無(wú)共價(jià)鍵形成，是一定離子濃度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到 ELISA的水平。而結(jié)合銀染色時(shí)，檢測(cè)的敏感性更大大提高。9 : r9 C/ J* b" e5 U7 Z; S; A& w# w( G5 h7 , p: U2 R( T2免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用4 P) h( j0 k) P8 Y膠體金標(biāo)記技術(shù)由于標(biāo)記物的制備簡(jiǎn)便，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物，也不要熒光顯微鏡，它的應(yīng)用范圍廣，除應(yīng)用于光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應(yīng)用于各種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析以及流式細(xì)胞術(shù)等。6 M9 D. t6 G. d（1）液相免疫測(cè)定：: g; o- V' |9 z6 y- J8 S將膠體金與抗體結(jié)合，建立微量凝集試驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的抗原，如間接血凝一