基因改造中快速PCR定點(diǎn)突變方式應(yīng)用

1、基因改造中快速 PCR定點(diǎn)突變方式應(yīng)用【關(guān)鍵詞】銅鋅超氧化物歧化酶銅鋅超氧化物歧化酶（Cu , Zn-SOD）因?yàn)槟軌蚺懦?O-・2而被普遍應(yīng)用于延緩衰老和操縱炎癥，可是由于多種因素阻礙，尤其是Cu, Zn-SOD具有種質(zhì)特異性和在體內(nèi)停留時(shí)刻短（通常只有610min）,使得Cu , Zn-SOD的應(yīng)用受到專門大限制。定點(diǎn)突變 技術(shù)是改造、優(yōu)化基因經(jīng)常使用的手腕，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間 復(fù)雜關(guān)系的有效方式，在醫(yī)學(xué)上還可用于基因醫(yī)治等。目前經(jīng)常使用的定點(diǎn)突變方式有寡核甘酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變及盒式突變等1。但由于這些方式操作繁瑣，意外突變多等缺

2、點(diǎn)，使定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)受到必然限制。本研究采納一種最近幾年來(lái)新的定點(diǎn)突變技術(shù)一快速 PCR定點(diǎn)突變方式成功地對(duì) hCu , Zn-SOD進(jìn) 行了基因改良（將hCu, Zn-SOD基因中非活性中心的 Cys111密碼子突 變成Ala密碼子，以提高其穩(wěn)固性），同時(shí)對(duì)該定點(diǎn)突變技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行探討。1材料11菌株與質(zhì)粒 DH5 a,由本實(shí)驗(yàn)室保留。質(zhì)粒pESOD（含hCu, Zn-SOD基因、Ampr基因和EcoRI酶切位點(diǎn)，整個(gè)質(zhì)粒約 33kb） 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化于 DH5 a保留。12要緊試劑Pfu高保真DNA聚合酶（深圳晶美生物工程）；DpnI酶（河南華麗生物工程）；小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖?/p>

3、 （上海博亞生 物技術(shù)）;DNA Marker,T4DNA 連接酶，Eco RI等常規(guī)酶（上海Sangon公司）13 pESOD質(zhì)粒提取及鑒定 用質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖袕暮?pESOD質(zhì)粒的DH5 a轉(zhuǎn)化菌里提取pESOD質(zhì)粒，取部份質(zhì)粒用EcoRI 酶切后瓊脂糖電泳鑒定，另取部份質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)測(cè)序。14定點(diǎn)突變141引物設(shè)計(jì) 依照hCu, Zn-SOD基因序列和定點(diǎn)突變的要求（將hCu , Zn-SOD中第111位Cys的密碼子TGC突變成Ala密碼子GCC）設(shè)計(jì)出一對(duì)包括突變位點(diǎn)的引物 （正、反向）P1和P2,具體序列如 下：P1 : 5 ' CTCTCAGGAGACCAT

4、GCCATCATTGGCCGCAC3 'P2 : 5 ' GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG3 '。下戈U 線的堿基為突變位置。所有引物均由上海博亞生物技術(shù)合成。142 PCR定點(diǎn)突變 整個(gè)反映體系為50 n l ,其中含無(wú)菌去離子水 41 n l , 10 x Pfu Polymerase Buffer（ 含 Mg2+）5 l , 20 m mol/LP 一、P2 引物各 1 n l , pESOD 質(zhì)粒 1 n l（約 100ng） , Pfu DNA 聚合酶 1N l（5U）;反映條件為：94c預(yù)變性3min ;然后94c變性1min

5、 , 65c 30s, 72 c延伸7min , 25個(gè)循環(huán)；最后 72 c延伸7min , 4 c保留143轉(zhuǎn)化 用Dpn I限制性內(nèi)切酶處置PCR反映產(chǎn)物，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 a ,涂布培育后隨機(jī)挑3個(gè)菌落并提取相應(yīng)質(zhì)粒，由上海博亞生物技術(shù)育限公司測(cè)序，測(cè)序引物P3: 5ACTCAGGTACTGGGAGTG '。 3 2 結(jié)果21提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后瓊脂糖電泳 質(zhì)粒大小為3300bp左右，證明所提取的質(zhì)粒確實(shí)是 pESOD質(zhì)粒，見圖1。1: EcoRI 酶切后的 pESOD 質(zhì)粒;2 : Marker圖1 pESOD質(zhì)粒經(jīng)EeoRI酶切后瓊脂糖電泳（略）22 PESOD

6、質(zhì)粒測(cè)序的部份結(jié)果 所測(cè)序列與文獻(xiàn)2報(bào)導(dǎo)的hCu,Zn-SOD序列對(duì)照完全一致，證明 pESOD質(zhì)粒內(nèi)含的hCu,Zn-SOD 基因完全正確。23定點(diǎn)突變后3個(gè)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果及突變前后序列對(duì)照（圖2）3個(gè)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果有 2種，別離和文獻(xiàn)2的hCu , Zn-SOD序列對(duì)照：其中1個(gè)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果和 hCu,Zn-SOD基因序列完全一致，說(shuō)明突 變未成功；另外 2個(gè)質(zhì)粒別離有 2個(gè)堿基和 hfu,Zn-SOD因序列不同， 也確實(shí)是Cys的密碼子TGC變成了 Ala的密碼子GCC ,其他序列與hCu , Zn-SOD基因一致，符合預(yù)期要圖2中沒(méi)有短線條相連的部份為突 求；變前后2序列的不同的地方。A

7、:突變后的 hCu,Zn-SOD 基因序列；B: hCu,Zn-SOD基因序 列圖2 hCu,Zn-SOD基因突變前后部份序列對(duì)照（略）3討論通過(guò)快速PCR定點(diǎn)突變，本研究實(shí)現(xiàn)了把 hCu,Zn-SOD 基因 中的Cys111突變成Ala111 。整個(gè)突變進(jìn)程只需要 1次PCR反映、1 次DpnI酶解和1次轉(zhuǎn)化，即完成了定點(diǎn)突變， 無(wú)需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行結(jié) 尾處置，也無(wú)需進(jìn)行亞克隆等，大大減少了傳統(tǒng)定點(diǎn)突變的工作量，而 突變成功率較高（本次實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑取的3個(gè)菌落中有2個(gè)是陽(yáng)性突變菌 落），尤其適用于大腸埃希菌來(lái)源的 DNAO快速PCR定點(diǎn)突變的技術(shù)要點(diǎn)：（1）預(yù)備突變的質(zhì)粒必需是甲基化。（2）引

8、物是一對(duì)包括突變位點(diǎn)的互補(bǔ)的（正、反向）核昔酸鏈，而且要比一樣的PCR引物（18bp21bp）長(zhǎng)，一樣要在 25bp以上，因?yàn)橐镏泻型蛔兾稽c(diǎn)，和模板不能完全匹配。(3)須要高保真的DNA聚合酶如Pfu Turbo聚合酶。(4)PCR產(chǎn)物要用DpnI酶充分酶切消化，以提 高突變檢出率。(5)PCR延伸步驟時(shí)刻要充沛；因?yàn)?Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增速度為05kb/min ,比Taq酶慢1倍左右。(6)高保真Pfu DNA聚合 酶酶量要比一般PCR所需的Taq酶多一些；因Pfu DNA聚合酶不但擴(kuò) 增速度較慢，而且一步法 PCR定點(diǎn)突變擴(kuò)增的是整個(gè)質(zhì)粒，故所需的總時(shí)刻比一樣的PCR時(shí)刻要長(zhǎng)很多，適當(dāng)增加酶量以補(bǔ)充長(zhǎng)時(shí)刻高溫下的酶活力損失。(7)克隆子最后需經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證；高保真不等于100 %保真。本研究挑選測(cè)序的3個(gè)菌落中有1個(gè)是未突變的陰性菌落，故后續(xù)的測(cè)序步驟不能省略。參考文獻(xiàn)1羅師平，冷希崗.基于PCR的體外誘變技術(shù)J.國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)，2005,28(3):188-192.2 Sherman L,Da