逆境脅迫對(duì)植物生理生化代謝的影響

1、逆境脅迫對(duì)植物生理生化代謝的影響 摘要：干旱、鹽堿和低溫是強(qiáng)烈限制作物產(chǎn)量的三大非生物因素,其中干旱造成的損失最大, 其損失超過其他逆境造成損失的總和。對(duì)植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境稱為逆境，又稱脅迫。常見的逆境有寒冷、干旱、高溫、鹽漬等。逆境會(huì)傷害植物，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡。逆境對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)在細(xì)胞脫水、膜系統(tǒng)受破壞，酶活性受影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂。有些植物在長(zhǎng)期的適應(yīng)過程中形成了各種各樣抵抗或適應(yīng)逆境的本領(lǐng)，在生理上，以形成脅迫蛋白、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（如脯氨酸含量）、提高保護(hù)酶活性等方式提高細(xì)胞對(duì)各種逆境的抵抗能力。以小麥幼苗為材料，設(shè)置對(duì)照組，探究了干旱脅迫下脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(

2、GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量變化以及抗氧化酶(POD、PPO)活性的變化。結(jié)果表明：在干旱脅迫下，脯氨酸（pro）、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2的含量相對(duì)于對(duì)照組均有較明顯的上升趨勢(shì)，POD和PPO活性也表現(xiàn)出較大水平的提高。關(guān)鍵詞：干旱脅迫,抗逆性，脯氨酸，丙二醛，樣品，細(xì)胞膜透性，過氧化物酶活性，葉綠素，可溶性糖。谷胱甘肽；抗氧化酶；H2O2引言：干旱是我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展面臨的主要問題之一, 【1】干旱脅迫對(duì)植物的影響是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，涉及到許多生物大分子和小分子植物細(xì)胞膜起調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的作用，它的選擇透性是其最重要的功能之一?！?】研究

3、表明，游離的脯氨酸在植物細(xì)胞抵抗非生物脅迫過程中扮演著越來越重要的角色，許多新的生理功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)，近幾年來有關(guān)脯氨酸的研究倍受科學(xué)工作者的關(guān)注【9-13】。干旱是一種最常見的脅迫，遇此逆境作物除進(jìn)行氣孔調(diào)節(jié)外，滲透詞節(jié)也不夾為一種有效方法。原理是通過加強(qiáng)合成代謝，增加細(xì)胞內(nèi)滲透物質(zhì)濃度，降低滲透勢(shì)，維持膨壓和細(xì)胞正常生理功 能。脯氨酸作為水溶性最大的氮基酸(1623g· (100g)。H 2O，25 oC)具有較強(qiáng)水合能力，是理想的滲透介質(zhì)。作物遇旱時(shí)它的大量積累有助于細(xì)胞或組織持水，防止脫水，故可視為作物對(duì)干早環(huán)境的一種保護(hù)性適應(yīng)。已經(jīng)證明了在逆境條件下脯氨酸的積累來抵抗植物對(duì)

4、非生物脅迫的傷害，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)也能將傷害細(xì)胞的活性氧控制在可忍耐水平內(nèi)，通過各種過氧化酶的協(xié)同作用，可以把細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的具有很強(qiáng)氧化活性的活性氧如O2-、H2O2、OH-等直接或間接地清除，防止了活性氧放大級(jí)聯(lián)作用，保證了細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的，對(duì)干旱也具有抵抗作用。GSH作為生物體內(nèi)主要的還原態(tài)硫之一，在生物體抵抗各種脅迫(冷害、干旱、重金屬、真菌等)的過程中起著重要的作用，其含量水平的高低與植物對(duì)各種環(huán)境脅迫的忍耐程度密切相關(guān)。近些年來，它在高等植物代謝過程中的生理作用，尤其是在植物抵

5、御活性氧傷害過程中的作用及其與植物抗逆性關(guān)系的研究進(jìn)展很快。前人研究進(jìn)展植物在正常生長(zhǎng)情況下, 活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)植物在逆境條件下( 如干旱脅迫) 生長(zhǎng)時(shí), 這種平衡被打破, 體內(nèi)負(fù)責(zé)清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)能力下降, 從而造成活性氧的大量積累, 并引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用, 導(dǎo)致生物膜系統(tǒng)受損。過氧化物酶( POD) 、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物GSH(谷胱甘肽)等能夠有效地清除這些自由基, 是酶促防御系統(tǒng)的重要組成成分。人們根據(jù)這一理論對(duì)干旱脅迫下的許多作物如小麥【3-4】、大豆【5】、辣椒【6】、胡楊【7】等逆境生理過程進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)切入點(diǎn)與其它作物相比, 小麥

6、在干旱脅迫下具有獨(dú)特的生存策略, 是一種公認(rèn)抗逆性較強(qiáng)的作物, 利用干旱脅迫處理小麥幼苗, 測(cè)定其丙二醛( MDA) 含量、GSH含量、脯氨酸含量、H2O2含量及 PPO、 POD 活性變化, 探討干旱脅迫對(duì)小麥幼苗膜脂過氧化及酶保護(hù)系統(tǒng)的影響, 為進(jìn)一步明確大麥抗旱的生理機(jī)理提供一定理論依據(jù)。植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要作用。在正常情況下，細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)具有選擇透性能力。當(dāng)植物受到逆境影響時(shí)，如高溫、干旱、鹽漬、病原菌侵染后，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以至于植物細(xì)胞侵提液的電導(dǎo)率增大。膜透性增大的程度與逆境脅迫強(qiáng)度有關(guān)，也與植物抗逆性的強(qiáng)弱有關(guān)。

7、1 材料與方法1.1 種子發(fā)芽率的測(cè)定的材料培養(yǎng)和處理品種為晴3或魯玉13的玉米種子或小麥種子（購(gòu)于西山種子公司），用0.1%HgCL2消毒10min后，用蒸餾水漂洗干凈，再用蒸餾水于26下吸脹12h后即可用于實(shí)驗(yàn)。1.2 主要試劑：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水楊酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，內(nèi)含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 ，PBS, （pH=5.8,內(nèi)含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反應(yīng)混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木

8、酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反應(yīng)混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS現(xiàn)配)。主要儀器：分光光度儀，離心機(jī)，試管，微量加樣器，研缽等。1.3 余下實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)和處理小麥種子吸脹12h，在濕潤(rùn)濾紙上培養(yǎng)7天，正常組即對(duì)照組繼續(xù)正常培養(yǎng)，干旱組即實(shí)驗(yàn)組再干旱處理五天后用于實(shí)驗(yàn)。2方法2.1 種子發(fā)芽率的測(cè)定所采用的種子發(fā)芽率的測(cè)定方法是曙紅染色法和TTC染色法。凡是有生命活力的種子胚部，在呼吸作用過程中都有氧化還原反應(yīng)，而無生命活力的種子胚則無此反應(yīng)。當(dāng)TTC滲入種

9、胚的活細(xì)胞內(nèi)，并作為氫受體被脫氫輔酶（NADH2或NADPH2）上的氫還原時(shí)，便由無色的TTC變?yōu)榧t色的TTF【8】。用曙紅染色的，凡是全部著色或胚已著色的種子表示失去了生活力,播后不能發(fā)芽，生活力強(qiáng)的種子是不會(huì)著色的,因?yàn)榛罴?xì)胞具有半透性膜,可防止染料分子通過而不著色，死亡細(xì)胞,其壁膜失去半透性,染料分子易進(jìn)入,使原生質(zhì)著色。各取50粒吸脹的小麥種子沿胚的中心線切成兩半（嚴(yán)格區(qū)分兩個(gè)半粒），進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：其中50個(gè)半粒進(jìn)行TTC染色（30水浴 20 min）; 另50個(gè)半粒進(jìn)行曙紅染色（室溫染色10 min）。根據(jù)兩種方法的染色情況，分別計(jì)算發(fā)芽率。2.2 脯氨酸含量的測(cè)定用茚三酮法測(cè)定脯氨

10、酸含量，在酸性條件下，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)生成紅色化合物，在520nm下有最大吸收值。【13】分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胚芽鞘加入3 mL 3%磺基水楊酸（SSA）和少許石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。上清液各2 mL 分別加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮試劑煮沸15 min冷卻后5000 rpm離心10 min 分別測(cè)定A520。2.3 MDA含量用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量【18】。分別取0.1 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組加入3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少許石英砂充分研磨用2 mL PBS洗研缽5000 r

11、pm離心10 min 上清液定容至5 mL。測(cè)定：分別取上清液各2 mL 加入0.6%TBA（用0.6% TCA配制） 2 mL煮沸12 min冷卻后5000 rpm離心10 min 分別測(cè)定OD450和OD532.計(jì)算公式：OD450=C1×85.4OD532= C1×7.4+155000×C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71 OD450C2/（mol/L）=6.45 OD532- 0.56OD450,式中，C1為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度。2.4 抗氧化酶活性的測(cè)定用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，用鄰苯二酚法測(cè)定PPO活性。在有過氧化氫存在的

12、條件下過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)測(cè)量其含量，進(jìn)而計(jì)算POD的活性。多酚氧化酶能使鄰苯二酚氧化生成醌，用比色法測(cè)量其產(chǎn)物的形成，進(jìn)而計(jì)算出PPO的活性。POD測(cè)定：取POD反應(yīng)混合液（10mmol/L愈創(chuàng)木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液100 ml（空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng)3 min時(shí)的A470。PPO測(cè)定：取PPO反應(yīng)混合液（ 20 mmol/L鄰苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白調(diào)零用PBS取代），立即記時(shí)，搖勻，讀出反應(yīng) 2 min時(shí)的A410。計(jì)算公式：POD ac

13、tivities = (mmol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1FW)2.5 H2O2含量測(cè)定H2O2提取：分別取0.5 g實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，內(nèi)含1mM HA)和少許石英砂充分研磨用2 mL PBS洗研缽5000 rpm離心10 min 上清液定容至5 mL。測(cè)定：分別取上清液各3 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 1 mL搖勻 5000 rpm離心10 min OD410計(jì)算公式：H2O2 content = (mmol.g-1FW)3、 結(jié)果與分析。3.1種子發(fā)芽率的測(cè)

14、定分別計(jì)算兩種方法的發(fā)芽率：小麥：TTC法中， 3550=70%；曙紅染色法中，3850=76%。玉米：TTC法中， 3650=72%；曙紅染色法中，3250=64%。樣品 TCC方法 署紅染色法 50粒小麥種子 35粒具生命力 38粒具生命力 50粒玉米種子 36粒具生命力 32粒具生命力 3.2脯氨酸含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)組：A520=0.088, 對(duì)照組：A520=0.060，計(jì)算公式：Pro content=(mol.g-1FW)其中，V顯=6ml，V總=5ml，V用=2ml，520=3.24mol-1.cm-1,L=1cm,W=0.1g.計(jì)算結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組脯氨酸含量為4.074mol.g-1F

15、W，對(duì)照組脯氨酸含量為2.777mol.g-1FW.表一 Pro正常組和實(shí)驗(yàn)組的A520和Pro content干旱脅迫正常A520=0.088Procontent=4.074(mmol.g-1FW)A520=0.060Procontent =2.777(mmol.g-1FW)由上表可知，干旱脅迫下，脯氨酸的量是正常值的1.47倍，由此可以得到，干旱脅迫會(huì)造成脯氨酸的積累。但是，植物合成、累積及代謝是一個(gè)受非生物脅迫的一個(gè)過程，因此，脯氨酸的積累可能是生物受脅迫的一個(gè)信號(hào)。當(dāng)植物處于干旱條件下時(shí)，為了保護(hù)植物對(duì)干旱逆境的反應(yīng)，在干旱脅迫下，脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)急劇上升。而脯氨酸是水溶性最大的氨基

16、酸，這表明它具有易于水合的趨勢(shì)或具有較強(qiáng)的水合能力。它的增加可能是植物對(duì)干旱脅迫的一種保護(hù)性反應(yīng)。3.3、MDA含量測(cè)得的結(jié)果如下表所示：OD450OD532實(shí)驗(yàn)組1.500A0.454A對(duì)照組0.380A0.201A計(jì)算公式：OD450=C1×85.4OD532= C1×7.4+155000×C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71 OD450C2/（mol/L）=6.45 OD532-0.56OD450,式中，C1為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度。最后計(jì)算得出濃度如下表：實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組C1/（mmol/L）17.5654.446C2/（mol/L）

17、2.0881.084由上表可知，干旱脅迫下，丙二醛的濃度是正常情況下得2倍，因此，在干旱脅迫也會(huì)造成MDA的積累，MDA的最大特點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞中的許多物質(zhì)均有很強(qiáng)的破壞作用，因此，植物組織可能是通過產(chǎn)生并積累MDA等對(duì)細(xì)胞有害物質(zhì)，進(jìn)而破壞植物組織，使植物在逆境壞境中生長(zhǎng)不好。3.4、抗氧化酶的測(cè)定POD活性： 實(shí)驗(yàn)組為85.51 U.g-1FW，對(duì)照組為40.73 U.g-1FW.PPO活性： 實(shí)驗(yàn)組為4.385×10-4 mmol.g-1FWmin-1，對(duì)照組為4.002×10-4 mmol.g-1FWmin-1。表三 正常組和實(shí)驗(yàn)PPO和POD不同時(shí)間所測(cè)得值P

18、PO和POD 正常干旱脅迫PPO A410=0.115（1 min20S）PPO A410=0.126（1 min20S）POD A470= 1.16（1min20S）POD A470=2.457（1 min20 s） PPO activities =4320(U.g-1FW)PPO activities = 4737(U.g-1FW)PODactivities=807.4(mol.g-1FWmin-1)PODactivities=1710.2(mol.g-1FWmin-1)以上數(shù)據(jù)是通過以下方程計(jì)算而得POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)PP tivities

19、 = (U.g-1FW)由上表可知，在干旱脅迫下，也會(huì)造成PPO和POD的積累?？寡趸傅闹饕饔檬窍齊OS對(duì)植物的傷害，使抗氧化酶與ROS處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。在干旱脅迫下，抗氧化酶總體增加，說明，這一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系被打破，使植物不能消除ROS對(duì)自身的傷害，因而，逆境下植物生長(zhǎng)不好。3.5、 H2O2 的測(cè)定 表五 正常組和實(shí)驗(yàn)組H2O2的A410和H2O2 content 正常干旱脅迫A410=0.623A410=1.781H2O2content=10.09(mmol.g-1FW)H2O2 content=28.86(mmol.g-1FW)以上H2O2 content是通過以下公式計(jì)算而得：H2O2content = (mmol.g-1FW)由上表可知，干旱脅迫下，也會(huì)造成過氧化氫的積累。過氧化氫是體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，其積累對(duì)細(xì)胞具有氧化破壞作用，其含量的高低，一定程度上反映了CAT活性的高低。因此，在干旱脅迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成過