實(shí)驗(yàn)一植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)一．教學(xué)目標(biāo)：了解植物原生質(zhì)

1、實(shí)驗(yàn)一 植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)一教學(xué)目標(biāo)：了解植物原生質(zhì)體作為細(xì)胞工程研究的重要意義，了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。掌握分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)、方法和原理。掌握細(xì)胞活性的檢測方法。掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法。二重點(diǎn)：掌握分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)、方法和原理。掌握細(xì)胞活性的檢測方法。掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法。三難點(diǎn)：分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)。四授課方式與教學(xué)方法：講解原理、實(shí)驗(yàn)操作示范或具體指導(dǎo)。五教學(xué)內(nèi)容:實(shí)驗(yàn)原理植物原生質(zhì)體(protoplast)是除去細(xì)胞壁后 為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”,是開展基礎(chǔ)研 究的理想材料。其中,酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù),其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維

2、素、半纖維素和果膠質(zhì)組成,因而使用纖維素 酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分,除 去細(xì)胞壁,即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi) 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生質(zhì)體分離后不致膨脹破裂，滲透劑常用甘露醇或蔗糖，酶液還應(yīng)含一定Ca2+來穩(wěn)定原生質(zhì)膜。 其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液 的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質(zhì) 體的影響。將原生質(zhì)體接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞壁再生，細(xì)胞分裂和再生植株。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。

3、 一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原 生質(zhì)膜,因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無活力 的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。 細(xì)胞計(jì)數(shù)一般用血細(xì)胞計(jì)數(shù)極，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。從理論上講，植物體的任何一部分都可以通過酶解作用去除細(xì)胞壁而得到原生質(zhì)體。但在實(shí)際操作中，只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程。所以，為了制備健康的原生質(zhì)體，一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織為材料，一旦細(xì)胞具有木質(zhì)化或次生加厚的外壁，則不能被酶降解。因此，取材成為實(shí)驗(yàn)成功與否的首要問題。 花期短的花瓣，由于其組織鮮嫩，又具有色素標(biāo)記，是該實(shí)驗(yàn)中較好的材料。實(shí)驗(yàn)方法

4、1把葉片(或花期短的花瓣)洗凈，把表面水吸干。（2人一組）2撕去葉片背面的表皮，用2ml離心管的蓋打下1圓片。圓片扣壓于 0.5ml酶液面上。讓去除下表皮的一面接觸酶液，輔滿一層。0.5ml酶液已放入2ml離心管中。（酶液：4%纖維素酶， 2%果膠覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。32830保溫酶解26h（放培養(yǎng)箱中）；鏡檢葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。4600 rpm 離心5min，使原生質(zhì)體沉降。吸除上面的酶液。5加0.2 mol/L 的加氯化鈣液0.5ml，輕輕吹打均勻。6用1mL注射器向離心管底部緩緩注入20%的蔗糖溶液1ml，出現(xiàn)下部蔗糖液，上部原生質(zhì)體懸浮液.以60

5、0rpm離心10 min，在兩液相之間出現(xiàn)一條綠色帶，便是純凈的原生質(zhì)體。7用1mL注射器取出管底的雜質(zhì)、下部蔗糖溶液和上部氯化鈣液。少許原生質(zhì)體于載片上，蓋片觀察其形態(tài)，檢測純度。8加MS培養(yǎng)液液1ml洗滌，輕輕混勻，600 rpm 離心5min，使原生質(zhì)體沉降。吸除上面的溶液。9加MS培養(yǎng)液液0.5ml, 輕輕混勻, 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度, FDA染色測定原生質(zhì)體的活性。10扣上蓋子，在26下進(jìn)行暗培養(yǎng)。觀察細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞分裂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果討論六課堂小結(jié)：根據(jù)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。 細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用：細(xì)胞計(jì)數(shù)板系一長方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer)

6、 計(jì)數(shù)板在中央橫溝的兩邊各有一計(jì)數(shù)室，兩計(jì)數(shù)室結(jié)構(gòu)完全相同。計(jì)數(shù)室較兩邊的蓋玻片支柱低0.1毫米。因此，放上蓋玻片時，計(jì)數(shù)板與其間距即計(jì)數(shù)室空間的高為0.1毫米(圖8-1)。在低倍顯微鏡下可見計(jì)數(shù)室被雙線劃分成個邊長為毫米的大方格。四角的大方格又各分為個中方格，這是用來計(jì)數(shù)白細(xì)胞的。中央大方格被劃分為個中方格，每一中方格又劃分成個小方格(圖82稱×=400小方格，也有的計(jì)數(shù)板為×=400格的，小方格面積一致)。中央大方格的四角及中心個中方格(×者則為四角上的中方格)為紅細(xì)胞或血小板計(jì)數(shù)范圍。細(xì)胞計(jì)數(shù)先用試管稀釋法制備禽類血細(xì)胞懸液：將禽類紅細(xì)胞稀釋液、分別置水浴鍋

7、中預(yù)熱到，取液mL于試管中，用吸血管加入新鮮雞血(或肝素抗凝血)霯，再加入液mL混勻，置該水浴鍋中保溫s左右，置室溫，即為待檢的血細(xì)胞懸液?？捎糜诔湟河?jì)數(shù)。取干潔的計(jì)數(shù)板，置于水平的顯微鏡載物臺上，蓋上蓋玻片，使兩側(cè)各空出少許。搖勻血細(xì)胞懸液，用滴管吸取，將滴管尖輕輕置于蓋玻片邊緣外，讓滴出的血細(xì)胞懸液憑毛細(xì)管作用吸入計(jì)數(shù)室內(nèi)，剛好充滿計(jì)數(shù)室為宜(圖83)。靜置min后計(jì)數(shù)，先用低倍鏡觀察，不均勻則拋棄。計(jì)數(shù)時用虹彩、集光器、反光鏡等調(diào)節(jié)入射光角度和強(qiáng)度，認(rèn)清 計(jì)數(shù)室位置。采用“由上至下，由左至右，順序如弓”的順序，對壓邊線細(xì)胞采取“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則(圖84)。依次計(jì)數(shù)并記錄個中

8、方格中分別有多少個紅細(xì)胞。注意事項(xiàng)1計(jì)數(shù)板、蓋玻片和測定管用清水沖洗，再用綢布或細(xì)布沾干。2.充液前應(yīng)充分混勻血細(xì)胞懸液，充液要連續(xù)、適量，充液后應(yīng)待血細(xì)胞下沉后再計(jì)數(shù)。3.計(jì)數(shù)板、蓋玻片、吸血管及測定管等用過后必須立即按要求洗滌干凈。實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞膜的通透性觀察實(shí) 驗(yàn) 目 的 了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 將紅細(xì)胞放入數(shù)種等滲溶液中，由于紅細(xì)胞對各種溶質(zhì)的透性不同，有的溶質(zhì)可以滲入，有的不能滲入，滲入的溶質(zhì)能夠提高紅細(xì)胞的滲透壓，所以促使水分進(jìn)入細(xì)胞，引起溶血，由于溶質(zhì)透入速度互不相同，因此溶血時間也不相同。 實(shí) 驗(yàn) 用 品 一、器材 50ml燒杯, 試管（11

9、0cm）, 10ml移液管, 試管架。 二、材料 羊血。 三、試劑 0.17mol/L氯化鈉，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸鈉，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸鈉，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 一、羊血細(xì)胞懸液取50ml小燒杯一個，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化鈉，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的羊血。二、低滲溶液取試管一支，加入10ml蒸餾水，再加入1ml稀釋羊血，注意觀察溶液顏色的變化，有不透明的紅色逐漸澄清，說明紅細(xì)胞發(fā)生破裂造成100%紅細(xì)

10、胞溶血，使光線比較容易透過溶液。三、羊紅細(xì)胞的滲透性1、取試管一支，加入0.17mol/L氯化鈉10ml，再加入1ml稀釋羊血，輕輕搖動，注意觀察溶液顏色有無變化？有無溶血現(xiàn)象？為什么？2、取試管一支，加入0.17mol/L氯化胺10ml，再加入1ml稀釋羊血，輕輕搖動，注意觀察溶液顏色有無變化？有無溶血現(xiàn)象？為什么？3、分別在另外8種等滲溶液中進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)。步驟同2。實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較和分析。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞骨架的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼霉鈱W(xué)顯微鏡觀察植物細(xì)胞骨架的原理 及方法，觀察光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)。 二、實(shí)驗(yàn)原理植物細(xì)胞用適當(dāng)濃度的TritonX100處理 后，可

11、破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋 白質(zhì)卻保護(hù)完好?？捡R斯亮藍(lán)R250(Coomassie brilliant blue R250)是一種蛋白質(zhì)染料，處理后 的材料用考馬斯亮藍(lán)R250(考馬斯亮藍(lán)R250) 染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察，可以見到一種網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)，即是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。三、材料洋蔥鱗葉四、試劑1)2考馬斯亮藍(lán)R250染色液：稱考馬 斯亮藍(lán)R2501g，溶于250ml無水乙醇中，加 冰醋酸35ml.再加蒸餾至500ml. (2)磷酸緩沖液(pH 68)：60mmolL 磷酸緩沖液，調(diào)至pH6.8 (3)M緩沖液(pH 72)50mmolL咪唑， 50mmol/L)氯化鉀、05mmolL氯

12、化鎂、1mmol/L 乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、0.1mmol/L乙二胺四乙酸； 1mmolL巰基乙醇，調(diào)至pH 72。 (4)1%Trion X-100：用M緩沖液配制。 (5)3%戊二醛：用磷酸緩沖液配制； (6)中性樹膠。 儀器(請參看儀器圖庫)：顯微鏡，燒杯，鑷子。玻璃滴管，載玻片 五、實(shí)驗(yàn)步驟1.用鑷子撕取洋蔥鱗葉內(nèi)側(cè)的表皮若干片 約1cm2大小若干片)，置于50mL燒杯中，加 入pH6.8磷酸緩沖液，使其下沉； 2.吸去磷酸緩沖液，用1Triton X100 處理20min。3.吸去Triton X100，用M緩沖液洗3 次,每次5min。 4.用3戊二醛固定30min。 5

13、.磷酸緩沖液(pH 68)洗3次，每次5min。6.0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色10min。 7.蒸餾水洗2次，然后將樣品置于載玻片上,加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。 8.如果染色效果好，則可依次用50乙 醇、70%乙醇,95乙醇、正丁醇、二甲苯處理 樣品,各5min,然后將樣品平展于載玻片上，加 一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，制成永久切片。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告描繪所觀察到的洋蔥鱗葉細(xì)胞骨架圖。實(shí)驗(yàn)四、線粒體和液泡系的超活染色與觀察活體染色是能使生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)

14、變化以致引起細(xì)胞的死亡?；铙w染色技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。 通常把活體染色分為體內(nèi)活體染色與體外活體染色兩類。體外活體染色又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學(xué)”特性。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應(yīng)選擇那些對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，且使用時需要配成稀淡的溶液。一般說來，最

15、為適用的是堿性染料，這可能是因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。 實(shí) 驗(yàn) 目 的1、觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布； 2、學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。實(shí) 驗(yàn) 原 理 線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。活體染色是應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實(shí)地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動的一種染色方法。詹納

16、斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。 實(shí) 驗(yàn) 用 品1、器材 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。 2、試劑（1）Ringer溶液： 氯化鈉 0.85g (變溫動物用0.65g) 氯化鉀 0.25g 氯化鉀 0.25g 氯化鈣 0.03g 蒸餾水 100ml （2）10

17、%、1/3000中性紅溶液： 稱取0.5g中性紅溶于50ml Ringer液，稍加熱 (3040)使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。（3） 1%、1/5000詹納斯綠B溶液 稱取50mg詹納斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微熱(3040)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。 實(shí)驗(yàn)材料 人口腔上皮細(xì)胞，小麥種子或黃豆幼根根尖。

18、實(shí) 驗(yàn) 方 法1、人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2、植物細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察 取豆芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的

19、圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。實(shí)驗(yàn)報(bào)告（1）. 繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布 （2）. 繪蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞示液泡系的形態(tài)與分布實(shí)驗(yàn)五 葉綠體的分離與熒光觀察葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的, 由于具有這一重要功能，所以葉綠體一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對象。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，利用低速離心即可分離集中進(jìn)行各種研究。 實(shí) 驗(yàn) 目

20、的 1. 通過植物細(xì)胞葉綠體的分離, 了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。 2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。 實(shí) 驗(yàn) 原 理 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。 葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進(jìn)行,

21、以免滲透壓的改變使葉綠體到損傷。將勻漿液1000r/min的條件下離心2min, 以去除其中的組織殘?jiān)臀幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后，在3000r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。分離過程最好在05的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。 利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間, 有必要時立即拍照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。 實(shí) 驗(yàn) 用 品 一、器材 1.主要設(shè)備: 普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡。 2.小型器材: 500ml燒杯2個,

22、 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 二、材料 新鮮菠菜。 三、試劑 0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 一、葉綠體的分離與觀察 1. 選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。 2. 利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/min)勻槳35min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min。棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即不葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮、 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。 (1)在普通光鏡下觀察。 (2)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光。 (3)在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光：取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料, 加蓋片后即可在熒光顯微鏡下觀察。 二、菠菜葉手切片觀察 用剔須刀片將新鮮的嫩菠菜葉切削出一斜面置于載玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加蓋片后輕壓，