細胞生物學(xué)方法

1、醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的研究方法醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)的研究方法u顯微技術(shù)顯微技術(shù) u生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) u細胞分離技術(shù)細胞分離技術(shù) u細胞培養(yǎng)與細胞雜交細胞培養(yǎng)與細胞雜交一、顯微技術(shù)一、顯微技術(shù) 顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。類。 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 光鏡樣本制作光鏡樣本制作顯微鏡物象是否清楚不僅決定顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（辨力（resolution）有關(guān)。有關(guān)。分辨率分辨率是指區(qū)分開兩個

2、質(zhì)點間的最小距離熒光顯微鏡熒光顯微鏡 細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這類物質(zhì)進行定性和定量研究。類物質(zhì)進行定性和定量研究。光源為紫外光，波長較短，分光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位最有力生物大分子的定性

3、定位最有力的工具。的工具。 熒光顯微鏡照片熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色） 激光共聚焦掃描顯微鏡激光共聚焦掃描顯微鏡 藍色為細胞核藍色為細胞核綠色為微管綠色為微管 激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，由于激光束的波長較激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的通光學(xué)顯微鏡的3倍。倍。 調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信

4、息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。品的立體結(jié)構(gòu)。 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至利用這種顯微鏡能見到小至 4200nm的微的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。倍。 相差顯微鏡相差顯微鏡把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，把透過標本的可見光的光程差變成

5、振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。色的標本和活細胞。一種介殼蟲的一種介殼蟲的染色體染色體 微分干涉差顯微鏡（微分干涉差顯微鏡（DIC) 優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，使細胞的結(jié)構(gòu)體投影影像，使細胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細胞器，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。特別強，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基

6、因等的顯微操作常在這轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。種顯微鏡下進行。 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 用于觀察培養(yǎng)的用于觀察培養(yǎng)的活細胞活細胞 透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 1932年年Ruska發(fā)明了以發(fā)明了以電子束為光源，電子束為光源，用電磁用電磁場作透鏡場作透鏡的電子顯微鏡的電子顯微鏡 。電子顯微鏡的放大倍數(shù)電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍最高可達近百萬倍 p透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 p掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 s工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器

7、轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘枺俳?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。 CO 2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。RER的形態(tài)的形態(tài) 顯微操作顯微操作/注射儀注射儀 二、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)二、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) u細胞化學(xué)技術(shù)細胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)或細胞化學(xué)染色：是利用染色劑組織化學(xué)或細胞化學(xué)染色：是利用染色劑可同細胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的可同細胞的某種成分發(fā)生反應(yīng)而著色的原理，對某種

8、成分進行定性或定位研究原理，對某種成分進行定性或定位研究的技術(shù)。的技術(shù)。利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能利用這種方法對細胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機物、醛、蛋白質(zhì)、糖顯示，包括有無機物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等。類、脂類、核酸、酶等。 u免疫細胞化學(xué)免疫細胞化學(xué)根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。如果將抗體結(jié)合上標記物，再與組織中的如果將抗體結(jié)合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。出該

9、抗原存在于組織中的部位。常用的標記物有熒光素和酶。常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為熒光素標記的稱為免疫熒光法免疫熒光法酶標記的稱為酶標記的稱為酶標免疫法酶標免疫法u顯微光譜分析技術(shù)顯微光譜分析技術(shù)細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為收波長為260nm，而蛋白質(zhì)的則為，而蛋白質(zhì)的則為280nm。根據(jù)細胞成分所具有的這種特性，可利用根據(jù)細胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定

10、顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性，甚至定量測定性，甚至定量測定 u放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)用于研究標記化合物在機體、組織和細胞用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。作用機理、作用部位等等。原理是將放射性同位素（如原理是將放射性同位素（如14C和和3H）標記）標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，將標本制成切片的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，組織中的放射或涂片，涂上鹵化銀乳膠，組織中的放射性即可使乳膠感光。顯示還原的黑色銀顆性即可使乳膠感光。顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記

11、物的準確位置和粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數(shù)量。數(shù)量。 u分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結(jié)合，子片段，在適當條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。間是否具有互補關(guān)系。 Southern blotuPCRPCR技術(shù)技術(shù)聚合酶鏈式反應(yīng)（聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于在體外將微量的目）用

12、于在體外將微量的目標標DNA大量擴增，以便進行分析。大量擴增，以便進行分析。 PCR Cycle：人類染色體人類染色體端粒端粒DNA的的熒光原位雜交熒光原位雜交 最初是使用帶放射性的最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。 三、細胞分離技術(shù)三、細胞分離技術(shù) u離心技術(shù)離心技術(shù)u流式細胞術(shù)流式細胞術(shù) u細胞電泳細胞電泳

13、 離心技術(shù)離心技術(shù)差速離心差速離心 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。 速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀 用差速離心法分離已破碎的細胞各組份用差速離心法分離已破碎的細胞各組份 A等速度沉降，等速度沉降，B等密度沉降等密度沉降 離心技術(shù)離心技術(shù)密度梯度離心密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重

14、力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖?；C，蔗糖和多聚蔗糖。 用于精細組分或生物大分子的分用于精細組分或生物大分子的分離。離。u流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)是對單個細胞進行快速定量分析與分流式細胞術(shù)是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，頻振蕩控制的噴嘴，形成

15、包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計。胞計。 u細胞電泳細胞電泳在一定在一定PH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動的現(xiàn)象稱為外加電場的作用下發(fā)生泳動的

16、現(xiàn)象稱為細胞電泳細胞電泳。引起細胞電泳的電位值稱為引起細胞電泳的電位值稱為電位電位。各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞電荷量有各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞電荷量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同，因此所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同，因此可用來分離不同種類的細胞?？捎脕矸蛛x不同種類的細胞。在恒定的電場條件下，同種細胞的電泳速度相當穩(wěn)在恒定的電場條件下，同種細胞的電泳速度相當穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的定，因而可通過測定電泳速度來推算出細胞的電位電位。電位常因細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在電位常因細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價值。診斷

17、疾病上有一定價值。四、細胞培養(yǎng)與細胞雜交四、細胞培養(yǎng)與細胞雜交 u細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng) 選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研選用最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)究的技術(shù) 。u細胞融合細胞融合通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個或多個細胞合并成通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合或細胞雜交合或細胞雜交 。動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 基本原理基本原理1、細胞融合的概念：細胞融合的概念：在自然條件下或用人工在自然條件下或用人工方法使兩個或兩個以上的細胞合并成一個細胞方法使兩個或兩個以上

18、的細胞合并成一個細胞的過程。的過程。2、人工誘導(dǎo)方法：人工誘導(dǎo)方法：應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇3、可能的作用機制：可能的作用機制：聚乙二醇可引起細胞膜聚乙二醇可引起細胞膜中的磷脂的酰鍵及極性基團兩者在結(jié)構(gòu)上發(fā)生中的磷脂的酰鍵及極性基團兩者在結(jié)構(gòu)上發(fā)生重排。重排。植物細胞培養(yǎng) 1 1、組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。、組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。2 2、懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。、懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。3 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫壁后的植物細胞稱為原生質(zhì)體。、原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫壁后的植物細胞稱為原生質(zhì)體。4 4、單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株，經(jīng)人為加倍后可得、單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株，經(jīng)人為加倍后可得到完全純合的個體。到完全純合的個體。 正