細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)TechnologyTechnology of of Cell CultureCell Culture 王王 莉莉 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究：細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能,如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)藥物測試細(xì)胞培養(yǎng)藥物測試：藥物單因素及多因素的影響作用。 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：檢測T、B細(xì)胞數(shù)量及功能。 細(xì)胞用作毒性實(shí)驗(yàn)及安全性實(shí)

2、驗(yàn)細(xì)胞用作毒性實(shí)驗(yàn)及安全性實(shí)驗(yàn)：環(huán)境毒物等。細(xì)胞工程學(xué)研究手段已基本建立細(xì)胞工程學(xué)研究手段已基本建立：克隆技術(shù)等。遺傳疾病的產(chǎn)前檢查遺傳疾病的產(chǎn)前檢查：羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞培養(yǎng)。體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體外培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：腫瘤細(xì)胞與癌基因研究。在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用在雜交瘤技術(shù)中的應(yīng)用：單克隆抗體技術(shù)與應(yīng)用等。細(xì)胞培養(yǎng)在病毒學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)在病毒學(xué)中的應(yīng)用：SARS結(jié)構(gòu)與功能等。細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)在現(xiàn)代生物技術(shù)中應(yīng)用 ：如基因分離，基因測序與表達(dá)、基因轉(zhuǎn)移與重組，癌基因研究等。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail:

3、細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)概述 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture):使離體細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室人使離體細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室人工模擬機(jī)體內(nèi)的條件下，生長發(fā)育、分裂增殖的一工模擬機(jī)體內(nèi)的條件下，生長發(fā)育、分裂增殖的一項(xiàng)重要的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)。項(xiàng)重要的細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)。 動物和植物細(xì)胞培養(yǎng)(這里僅討論動物的細(xì)胞培養(yǎng))，簡稱細(xì)胞培養(yǎng)。 組織培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 器官培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)是把取得的組織用機(jī)械或消化的方法，分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行培養(yǎng)、增殖。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) 1.活細(xì)胞：活細(xì)胞：能長時(shí)間、直接觀察、

4、研究 活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動 2.可控制：可控制：重復(fù)性?？煽刂?調(diào)節(jié)條件：各種因素：物理、化學(xué)、生物等因素 3.研究的樣本具有均一性：可選擇對象研究的樣本具有均一性：可選擇對象：哪一種哪一種類型類型：上皮？間質(zhì)？性質(zhì)性質(zhì)：正常？腫瘤？階段階段： 4.便于觀測、檢測和記錄：便于觀測、檢測和記錄： 研究觀察研究觀察：倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；記錄記錄：攝影照片、縮時(shí)電影、電視- 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) 5.應(yīng)用廣應(yīng)用廣 學(xué)科多：對象廣：

5、各種動物：低等動物-高等動物-人類 一種動物：不同年齡- 不同組織- 正?；虍惓＃[瘤-） 6.較經(jīng)濟(jì)較經(jīng)濟(jì) 可提供大量、同時(shí)、重復(fù)性好的生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對象。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的缺點(diǎn) 現(xiàn)在人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高，但人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況，仍不完全相同。 當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，久了，必然發(fā)生變化。 與體內(nèi)主要不同：相對孤立、相對單一； 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。 主要表現(xiàn)主要表現(xiàn)：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)；分化減弱或不顯； 細(xì)胞趨向單一

6、化。 要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細(xì)胞；是一種特定條件下生長的細(xì)胞群體。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 一、細(xì)胞培養(yǎng)基本原理與技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)基本原理與技術(shù) (一一)細(xì)胞在體外生長的條件細(xì)胞在體外生長的條件 體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要合適的環(huán)境和必需的條件才能生存和繁殖。 1.細(xì)胞的營養(yǎng)需要細(xì)胞的營養(yǎng)需要 血漿或血纖維蛋白原凝塊中（早期），或在組織提取液等中生長?，F(xiàn)知需要一些基本營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子等物質(zhì)。 基本營養(yǎng)物質(zhì)基本營養(yǎng)物質(zhì) 包括：氨基酸氨基酸(12種必需種必需AA)、維生素、碳水化合物及一些無機(jī)離子。維生素、碳水化合物及一些無機(jī)離子。 促生長因子等物質(zhì)促生長因子等

7、物質(zhì) 除基本營養(yǎng)物質(zhì)外，培養(yǎng)細(xì)胞還需要促細(xì)胞生長因子等物質(zhì)(如EGF,IGF,IL等)才能正常生長、增殖。血清中含多種，但也有些組成不明，對細(xì)胞有害的成分。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 2.細(xì)胞的生存環(huán)境細(xì)胞的生存環(huán)境 細(xì)胞生存并繁殖的生理學(xué)能接受限度內(nèi)的物理化學(xué)特性，包括溫度、氣相及pH等。 溫度：溫度：人及哺乳動物體外培養(yǎng)細(xì)胞的理想溫度是35 37 。高溫比低溫對細(xì)胞的影響更為明顯。當(dāng)溫度為25 35 ，細(xì)胞生長很慢； 4 下能存活數(shù)天(不低于0 )，196 (保護(hù)劑)。 4142 下1h損傷嚴(yán)重， 43 以上則多數(shù)細(xì)胞將死亡。 氣相及氣相及pH：

8、5CO2+95%空氣空氣， 大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2 7.4下生長。 滲透壓：滲透壓：260 320mmol/L的滲透壓適于大多數(shù)細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 3. 無污染及無毒無污染及無毒 無毒無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。包括與細(xì)胞直接接觸者和間接接觸者（器皿和材料）。 污染污染包括細(xì)菌等微生物（細(xì)菌、霉菌、支原體）的污染。即使使用抗菌素仍是細(xì)胞培養(yǎng)中要非常注意的問題。 污染的另一問題是不同細(xì)胞類型的交叉污染。對不同細(xì)胞系操作時(shí)，應(yīng)避免使用同一瓶培養(yǎng)液。 培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)

9、學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 合適的環(huán)境和必需的條件合適的環(huán)境和必需的條件1營養(yǎng)需要營養(yǎng)需要2環(huán)環(huán) 境境 要要 求求3無毒及無污染無毒及無污染培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品無菌室無菌室孵育室孵育室洗滌消毒洗滌消毒滅菌室滅菌室觀察室觀察室準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室貯藏室貯藏室細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 室室操作間操作間緩沖間緩沖間更衣間更衣間 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作：無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲藏。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

10、楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 1.常用設(shè)備和用品常用設(shè)備和用品 超凈工作臺：超凈工作臺：組織組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作，避免微生求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。物及其他有害因素的影響。目前，超凈工作臺的廣泛使目前，超凈工作臺的廣泛使用，很大程度上方便了組織用，很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常細(xì)胞培養(yǎng)工作，并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。胞培養(yǎng)。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

11、楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 1.常用設(shè)備和用品常用設(shè)備和用品 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱:提供進(jìn)行細(xì)提供進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需要的一定量的胞培養(yǎng)時(shí)所需要的一定量的CO2(濃度為濃度為5),易于使培養(yǎng)液的易于使培養(yǎng)液的pH保保持穩(wěn)定，適用于開放或半開放培持穩(wěn)定，適用于開放或半開放培養(yǎng)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿養(yǎng)。由于這種培養(yǎng)方法培養(yǎng)器皿內(nèi)部與外界相通內(nèi)部與外界相通,培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔須保持清潔,應(yīng)定期以紫外線照射應(yīng)定期以紫外線照射或酒精消毒。同時(shí)培養(yǎng)箱應(yīng)放置或酒精消毒。同時(shí)培養(yǎng)箱應(yīng)放置盛有無菌蒸餾水的水槽盛

12、有無菌蒸餾水的水槽,防止培養(yǎng)防止培養(yǎng)液蒸發(fā)液蒸發(fā),使箱內(nèi)相對濕度始終保持使箱內(nèi)相對濕度始終保持為為100。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 1.常用設(shè)備和用品常用設(shè)備和用品 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 冰箱冰箱 離心機(jī)離心機(jī) 電熱干燥箱電熱干燥箱 水純化裝置水純化裝置 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 1.常用設(shè)備和用品常用設(shè)備和用品 高壓蒸汽消毒裝置高壓蒸汽消毒裝置 過濾除過濾除 菌裝置菌裝置 細(xì)胞冷凍

13、裝置細(xì)胞冷凍裝置 其他其他 移動式移動式臭氧空臭氧空氣消毒氣消毒機(jī)機(jī) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 儀 器 細(xì)胞冷凍儲存器細(xì)胞冷凍儲存器：常用液氮容器。新型的細(xì)胞冷凍儲存器可通過先進(jìn)的電子控制器實(shí)現(xiàn)凍存自動化并監(jiān)測液氮水平和樣品溫度；可配備先進(jìn)的報(bào)警系統(tǒng)，分別警報(bào)液氮液面、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：同時(shí)具備熱氣體旁路系統(tǒng)，防止高于-130的暖空氣進(jìn)入液氮罐，從而更有效地保護(hù)樣品，防止升溫。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 2.培養(yǎng)器皿培養(yǎng)器皿 培養(yǎng)

14、瓶 培養(yǎng)皿 多孔培養(yǎng)板 離心管 移液管和吸管 其他玻璃器皿 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 凍存管凍存管1.2ml 2ml，5ml 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 離心管離心管5ml， 10ml ，15ml50ml細(xì)胞刮細(xì)胞刮 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (二二) )培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品培養(yǎng)細(xì)胞常用設(shè)備和用品 3.解剖器械解剖器械 4.微量移液器微量移液器 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (三三) )培養(yǎng)用品的清洗培養(yǎng)用品的清洗

15、清洗和消毒滅菌的主要目的是去除器皿上雜質(zhì)及其對細(xì)胞清洗和消毒滅菌的主要目的是去除器皿上雜質(zhì)及其對細(xì)胞生長有影響的物質(zhì)及各種微生物。生長有影響的物質(zhì)及各種微生物。 1.玻璃器皿玻璃器皿：供細(xì)胞生長的玻璃表面不但要清潔干凈，：供細(xì)胞生長的玻璃表面不但要清潔干凈，而且要而且要帶適當(dāng)電荷帶適當(dāng)電荷。一般玻璃器皿的清洗分為。一般玻璃器皿的清洗分為4步。步。 (1)浸泡浸泡：新的玻璃器皿表面呈堿性，并帶有如鉛等，使：新的玻璃器皿表面呈堿性，并帶有如鉛等，使用前必須徹底清洗。先用自來水初步刷洗，用前必須徹底清洗。先用自來水初步刷洗，5 HCl中浸泡過中浸泡過夜，以中和其堿性。使用后的玻璃器皿應(yīng)立即浸入清水中

16、，避夜，以中和其堿性。使用后的玻璃器皿應(yīng)立即浸入清水中，避免器皿內(nèi)蛋白質(zhì)干涸后黏附于玻璃上難以清洗。免器皿內(nèi)蛋白質(zhì)干涸后黏附于玻璃上難以清洗。 (2)刷洗刷洗：去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。有兩點(diǎn)需注意：去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。有兩點(diǎn)需注意：一是防止損壞器皿表面光潔度，應(yīng)選擇軟毛毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑一是防止損壞器皿表面光潔度，應(yīng)選擇軟毛毛刷和優(yōu)質(zhì)洗滌劑,不宜用力過猛；二是不留死角不宜用力過猛；二是不留死角,要特別注意瓶角等部位。刷洗要特別注意瓶角等部位。刷洗后要將洗滌劑徹底沖洗干凈后要將洗滌劑徹底沖洗干凈,晾干。晾干。 (3)清潔液浸泡清潔液浸泡：清潔液由濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水：清潔液由濃硫酸、重鉻酸

17、鉀及蒸餾水配成。具有很強(qiáng)的氧化作用和去污能力配成。具有很強(qiáng)的氧化作用和去污能力,對玻璃器皿無腐蝕。對玻璃器皿無腐蝕。經(jīng)清潔液浸泡后經(jīng)清潔液浸泡后,殘留的未刷洗掉的微量雜質(zhì)可被完全清除。殘留的未刷洗掉的微量雜質(zhì)可被完全清除。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 清潔液清潔液可配制成三種不同的強(qiáng)度,其成分用量見下表 。弱液 次強(qiáng)液 強(qiáng)液重鉻酸鉀（g）100120 63濃硫酸（ml） 100200 1000蒸餾水（ml） 1000 1000 200 細(xì)胞培養(yǎng)物品清洗所需配制的清潔液常為次強(qiáng)液。新配制的呈棕紅色，經(jīng)多次使用、水分增多或遇有機(jī)溶劑時(shí)為綠色，已失效，應(yīng)重新

18、配制。 10%30%的硝酸溶液硝酸溶液也常用作清潔液。( (三三) )培養(yǎng)用品的清洗培養(yǎng)用品的清洗 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: (三) 培養(yǎng)用品的清洗 2.橡膠用品橡膠用品：組織培養(yǎng)液中使用的膠塞、培養(yǎng)瓶蓋子、針頭等均不能以清潔液浸泡。清洗過程中，新的膠塞因帶有滑石粉，應(yīng)先用自來水沖洗干凈，再進(jìn)行常規(guī)清洗；使用后的膠塞、蓋子應(yīng)及時(shí)浸泡在清水中。然后用洗滌劑刷洗。 3.塑料器皿塑料器皿：包括各種培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶等。這些產(chǎn)品主要為進(jìn)口的一次性物品，供應(yīng)商提供給用戶時(shí)已消毒滅菌并密封包裝，打開包裝即可使用。由于各種原因，部分實(shí)驗(yàn)室尚未能做到將這類物品完

19、全作一次性使用，仍需經(jīng)過清洗和消毒滅菌后反復(fù)使用。清洗方法通常是：用后立即以流水沖洗干凈或浸入水中，防止干涸。超聲波清洗機(jī)超聲波清洗機(jī)內(nèi)加入少量洗滌劑清洗30min，流水徹底沖洗干凈，清潔液浸泡過夜，流水徹底將殘留清潔液沖洗干凈，蒸餾水漂洗23次，三蒸水漂洗2次，晾干備用。亦可采用下述步驟：器皿經(jīng)沖洗干凈后，晾干，2NaOH浸泡過夜，自來水沖洗，5鹽酸浸泡30min，流水徹底沖洗，蒸餾水漂洗。但不宜反復(fù)使用次數(shù)太多。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: （三） 培養(yǎng)用品的清洗 4.包裝包裝:組織培養(yǎng)的器皿需清洗、晾干。在消毒前必須進(jìn)行包裝，以便消毒及儲存，防止

20、落入灰塵及消毒后再次被污染。 一般用皺紋包裝紙、硫酸紙、牛皮紙、棉布皺紋包裝紙、硫酸紙、牛皮紙、棉布等作為包裝材料，對培養(yǎng)瓶、濾器、存放培養(yǎng)液用貯液瓶、吸管和膠塞（或培養(yǎng)瓶蓋子）等物品的容器瓶口部分做局部包裝密封，再用牛皮紙、玻璃紙或布包起來備用。對體積小的培養(yǎng)皿、移液器吸頭等可以全封閉包裝。 注射器、金屬器械可直接裝入鋁制飯盒或不銹鋼鋁制飯盒或不銹鋼等容器等容器內(nèi)。重復(fù)使用的培養(yǎng)板則用優(yōu)質(zhì)塑料紙嚴(yán)密封口。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: （四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒 根據(jù)材料的要求可采用不同的消毒滅菌方法?？偟恼f來有物理方法及化學(xué)方法兩大類。物理方法物理方

21、法包括用濕熱(高壓蒸汽)、干熱、紫外線、射線、過濾、離心沉淀等方法殺滅或去除微生物；化學(xué)方法化學(xué)方法是使用化學(xué)消毒劑、抗菌素等殺滅微生物。以下重點(diǎn)介紹組織細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)工作常用的幾種消毒方法： 1.干熱消毒干熱消毒：一般在烤箱中進(jìn)行，主要用于消毒玻璃器皿。干熱消毒后的器皿干燥，易保存。缺點(diǎn)是干熱傳導(dǎo)慢，可能有冷空氣存留于烤箱內(nèi)，因此要用較高的溫度和較長的時(shí)間才能達(dá)到消毒的目的，需加溫到160，保持90120min方能殺死芽孢。消毒完畢后不可馬上將烤箱門打開，以免冷空氣突然進(jìn)入，影響消毒效果和損壞玻璃器皿或發(fā)生意外事故。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 2.濕

22、熱消毒濕熱消毒：濕熱消毒是一種有效的消毒方法,一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒。為了保證消毒的效果，消毒物品不應(yīng)裝得太滿，以便消毒器內(nèi)氣體流通；導(dǎo)氣管要伸至罐底并防止堵塞，在加熱升壓之前，打開排氣閥門，使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。冷空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，開始升壓，待達(dá)到所需要的壓力時(shí)，開始記錄時(shí)間，并控制壓力恒定。高壓消毒可在5、10、15、20磅的壓力下進(jìn)行，持續(xù)時(shí)間可為10、15、20、30min。 根據(jù)不同的物品選擇不同壓力和時(shí)間，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20min，一些常規(guī)使用的液體的消毒要求為15磅15min，橡膠用品為10磅10min。一般

23、認(rèn)為在這種情況下于1min內(nèi)幾乎可殺死所有微生物，但由于在消毒物品的包裝內(nèi)可能仍有冷空氣未全部排出或蒸汽尚未能達(dá)到消毒器內(nèi)的各部分，所以要延長消毒時(shí)間。消毒完畢后一定要先打開閥門放氣，再打開消毒器的蓋，以免發(fā)生意外。 （四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒（四）培養(yǎng)用品的滅菌與消毒 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 脈動真空滅菌器脈動真空滅菌器 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消毒滅菌的方法 3.紫外線消毒紫外線消毒：紫外線直接照射消毒是目前各實(shí)驗(yàn)室常用的方法之一，主要用于實(shí)驗(yàn)室房間里的空氣、操作臺表面及桌椅等消毒。 但在房間內(nèi)安裝

24、不能高于2.5m。要使各處達(dá)到0.06w/cm2的能量照射，否則影響消毒效果。 也可以用紫外線消毒一些塑料培養(yǎng)器皿（如塑料培養(yǎng)皿、塑料培養(yǎng)板等）。缺點(diǎn)是消毒有死角。 現(xiàn)已有電子滅菌燈可以代替紫外線燈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的空氣消毒。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消毒滅菌的方法 4.過濾除菌消毒過濾除菌消毒：血清、合成培養(yǎng)液、酶及含有蛋白質(zhì)具有生物活性的液體等不能用高壓消毒的方法進(jìn)行滅菌，可采用過濾方法除菌。濾器有抽吸(抽濾)式及加壓式兩種類型；濾板(或?yàn)V膜)結(jié)構(gòu)可為石棉板、玻璃或微孔膜。 (1) 玻璃濾器玻璃濾器：以燒結(jié)玻璃為濾板固定于玻璃漏斗上。 一般都使用G6

25、型。其缺點(diǎn)是速度較慢。 (2)微孔濾膜濾器微孔濾膜濾器：為金屬結(jié)構(gòu)，但其中間為一種一次性的特制混合纖維素脂濾膜?？捎糜诎ㄑ逶趦?nèi)的各種培養(yǎng)液的過濾除菌，速度較快，效果較好。 微孔濾膜濾器可為加壓式(正壓式)或抽濾式,由于加壓式微孔濾膜濾器過濾效果好、使用方便、易清洗，目前使用最為廣泛。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消毒滅菌的方法針頭式濾器 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消毒滅菌的方法 5.消毒劑及抗菌素消毒劑及抗菌素：組織細(xì)胞培養(yǎng)工作中也可利

26、用消毒劑來進(jìn)行滅菌處理，消毒劑主要是75酒精、過氧乙酸、乳酸等化學(xué)制劑?？煞謩e用于操作人員的皮膚、實(shí)驗(yàn)臺、器械、器皿的操作表面，實(shí)驗(yàn)室的桌、椅、墻壁、地面及空氣等的處理。如75酒精最為常用，用途也最廣泛；0.1新潔爾滅可對器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒；乳酸可用于空氣消毒；另外尚有各種用于地面消毒的消毒液（例如三花消毒液、過氧乙酸等）可供選用。 抗菌素也常在組織細(xì)胞培養(yǎng)中使用，但多數(shù)是為了預(yù)防。要注意的是不能完全依賴抗菌素來達(dá)到消毒滅菌。常用的抗菌素為青霉素和鏈霉素。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消毒滅菌的方法 6.其他方法：其他方法： (1)

27、 電子消毒器消毒滅菌：使用市售的電子滅菌器可消毒不宜高熱滅菌的器皿及用物，例如塑料制品等，消毒時(shí)間通常為30min，消毒完畢應(yīng)及時(shí)關(guān)閉消毒物品容器。 (2) 輻射滅菌：通常采用放射性60Co照射需滅菌的各種不宜高熱滅菌的器皿及用具以及部分實(shí)驗(yàn)用藥物、制劑等。 。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: (五)無菌操作的基本要領(lǐng)和要求 細(xì)胞培養(yǎng)工作中的消毒滅菌方法如上面所述可有多種，應(yīng)根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆椒ā?實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的消毒實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的消毒：實(shí)驗(yàn)室中空氣的消毒，最理想是采用過濾系統(tǒng)與恒溫設(shè)備結(jié)合使用，但價(jià)格較昂貴。亦可用紫外線消毒。另外尚可用乳酸等蒸汽或電

28、子滅菌燈消毒。實(shí)驗(yàn)室的地面多用新潔爾滅溶液等處理。桌椅等亦多用消毒劑消毒處理，最常用的是以酒精擦拭，亦可用紫外線照射。 超凈工作臺的消毒超凈工作臺的消毒 洗手和著裝洗手和著裝 火焰消毒火焰消毒 無菌培養(yǎng)操作無菌培養(yǎng)操作 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)除必須有培養(yǎng)基（液）外，還需要水和大量不同的溶液，包括鹽溶液、消化液、緩沖液、抗菌素液及用于檢測的各種染液等。 所需試劑及器械主要包括所需試劑及器械主要包括：干粉型培養(yǎng)基、胰干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素、純凈水系統(tǒng)、電子天平、蛋白酶，青霉素、鏈霉素、純凈水系統(tǒng)、電子天平、pH計(jì)、磁力攪

29、拌器、濾器、微孔濾膜、計(jì)、磁力攪拌器、濾器、微孔濾膜、O2、燒杯、燒杯、量桶、貯液瓶、瓶塞、注射器、三蒸水、胎量桶、貯液瓶、瓶塞、注射器、三蒸水、胎(小小)牛血牛血清、清、NaOH、HCl、高壓滅菌器等。、高壓滅菌器等。 平衡鹽溶液(六)細(xì)胞培養(yǎng)用液 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: (六)細(xì)胞培養(yǎng)用液 1. 平衡鹽溶液平衡鹽溶液 平衡鹽溶液平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿平衡的作用，并可供細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分，另外尚可用作洗滌組織、細(xì)胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。 平衡鹽溶液(BS

30、S)主要是由無機(jī)鹽和葡萄糖組成，其中無機(jī)離子是細(xì)胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細(xì)胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細(xì)胞代謝提供能量。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 水 體外培養(yǎng)細(xì)胞對水的質(zhì)量非常敏感，要求很高。水的純度不夠,即使有害元素含量極少對，細(xì)胞也會產(chǎn)生不利的影響，有時(shí)引起細(xì)胞中毒死亡。 因此配制所有的培養(yǎng)液和各種溶液應(yīng)使用純化水。組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾組織培養(yǎng)必須使用玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水器制備的三次蒸餾水。二次蒸餾水或一次蒸餾水可用以清洗器皿或配制一般洗

31、液。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 平衡鹽溶液 平衡鹽溶液平衡鹽溶液(BSS) 主要是由無機(jī)鹽和葡萄糖組成，其中無機(jī)離子是細(xì)胞生命的必要成分；在維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)溶液pH方面也起著重要作用。Ca2+、Mg2+能為酶系統(tǒng)的活化提供條件，也是細(xì)胞膜的重要組成成分。葡萄糖等可為細(xì)胞代謝提供能量。 目前最常用的目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在細(xì)胞培養(yǎng)中，BSS用途如下：作為配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)溶液。配制各種試液：如配“胰酶”消化液。 用于洗滌組織和細(xì)胞。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 平衡鹽溶液

32、 PBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl8.006.808.008.008.00KCl0.200.400.400.200.40Ca(Cl)20.200.140.10Mg(Cl)26H2O 0.10MgSO47H2O0.200.20Na2HPO42H2O1.560.061.420.06NaH2PO4H2O0.14KH2PO40.200.060.200.06NaHCO32.200.350.35Glucose(葡萄糖)1.001.00Phenol red(酚紅)0.020.020.020.02 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 為了便于保

33、存和減少有關(guān)成分的化學(xué)反應(yīng)，此液可配成20 、10 和 5 濃縮液的儲存液(母液)。 10 母液配制法 甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列試劑 NaC1 80.0g KCl 4.0g MgSO4 7H2O 2.0g CaC12 1.4g (2H2O 1.85g) 待完全溶解后，補(bǔ)足三蒸水至500ml。 乙液：取 450ml三蒸水依次溶解下列試劑 Na2HPO4 0.6g(12H2O 1.52g) KH2PO4 0.6g 葡萄糖 10.0g 0.4酚紅 50.0ml平衡鹽溶液 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 消化液（細(xì)胞分離液）消化液（細(xì)胞分離液） 常用的

34、細(xì)胞分離液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和膠原酶等，它們在制備原代細(xì)胞時(shí)可消化組織、分散細(xì)胞，在傳代細(xì)胞時(shí)使細(xì)胞脫離生長表面(瓶壁)和使細(xì)胞團(tuán)離散成單個(gè)細(xì)胞。 它們可單獨(dú)使用，也可按一定比例混合使用，這主要取決于所培養(yǎng)細(xì)胞的要求。消化液 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 胰蛋白酶 胰蛋白酶胰蛋白酶:主要來自牛或豬的胰臟，淡黃色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞離散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分別能解離125份和250份酪蛋白,胰酶的離散作用與細(xì)胞的種類和特性密切相

35、關(guān)。不同細(xì)胞系對胰酶溶液的作用濃度、溫度和時(shí)間等的要求也不一樣。 濃度大、溫度高、作用時(shí)間長對細(xì)胞的分離能力也越大，但超過一定限度也會損傷細(xì)胞、胰酶在pH8.0，溫度37時(shí)，作用力最強(qiáng)。Ca2+、Mg2+ 、血清、蛋白質(zhì)的存在會降低其活力，可用無Ca2+、Mg2+的溶液配制，需要終止消化作用時(shí)，可加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液或胰酶抑制劑來終止胰酶對細(xì)胞的繼續(xù)作用。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: （2）乙二胺四乙酸鈉（）乙二胺四乙酸鈉（EDTA） EDTA是一種化學(xué)螫合劑，對細(xì)胞有一定的解離作用，且毒性小，常用濃度為0.02%。將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用

36、，會提高分散細(xì)胞的效力。 0.02%EDTA溶液(亦稱為Versen液)：稱取適量EDTA，用D-Hanks溶液溶解，10磅15min高壓滅菌，分裝小瓶，4冰箱保存。用于分散消化細(xì)胞。 （3）膠原酶）膠原酶 膠原酶的常用劑量為200U/Ml(約為1mg/ml）。培養(yǎng)用液-消化液 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 常用培養(yǎng)基（液）常用培養(yǎng)基（液） 培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培天然培養(yǎng)基養(yǎng)基，主要來自動物體液或從組織分離提取制備的，其營養(yǎng)成分較高，但成分復(fù)雜，個(gè)體差異較大，來源也有一定的限制。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)

37、模擬合成的，具有一定的組成，是較理想的培養(yǎng)基。但對動物細(xì)胞來說，它只能維持細(xì)胞的生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充天然培養(yǎng)基，即兩者混合在一起使用,效果更好。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn),促進(jìn)了組織培養(yǎng)的發(fā)展，避免了生物差異的影響,細(xì)胞生長健康透明,延長了體外存活的時(shí)間，價(jià)廉易制取。 培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基（natural media）包括：血清、組織提取液等。血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常使用的天然培養(yǎng)基。血清中含有許多能維持細(xì)胞生長增殖不可缺少的成分，如蛋白質(zhì)、多肽、激素及各種氨基酸、葡萄糖、酮酸等營養(yǎng)成分。 血清：

38、分人血清和動物血清兩大類。細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的是動物血清，來自牛、馬、兔等動物，其中牛血清比馬血清用得更廣泛。牛血清分為胎牛血清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）和小牛血清（calf serum，CS）兩種。培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: FBS是經(jīng)剖腹從母牛子宮中取出的胎牛中分離到的血清，價(jià)格貴；CS是從剛出生但尚未哺乳的小牛中分離到的血清。 購置的血清應(yīng)做熱滅活處理。將小牛血清置于56水浴中滅活30分鐘，以破壞補(bǔ)體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4冰箱中，無菌試驗(yàn)陰性。未滅活的血清不穩(wěn)定，應(yīng)保存于-20冰箱中。 F

39、BS (fetal bovine serum) 和和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS 乃錯(cuò)誤的乃錯(cuò)誤的使用字眼，請不要再使用。使用字眼，請不要再使用。 CS (calf serum) 則是指小牛血清則是指小牛血清 HS (horse serum) 則是指馬血清 天然培養(yǎng)基 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 許多早期的組織培養(yǎng)基主要成分是由動物產(chǎn)品或組織抽提物。1950年。Morgan和他的同事曾報(bào)道了他們努力生產(chǎn)一種完全限定營養(yǎng)來源的細(xì)胞培養(yǎng)基（69種成分的199配方，開

40、始了人工合成培養(yǎng)基的歷史 ）。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 （Synthetic media）是根據(jù)研究和了解細(xì)胞所需成分的基礎(chǔ)上配制而成的，現(xiàn)已成為普遍應(yīng)用的商品化的培養(yǎng)基。但合成培養(yǎng)基尚未成為十分完全的培養(yǎng)基，它只能維持細(xì)胞不死，而不能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長，使用時(shí)尚需添加天然培養(yǎng)基，主要是牛血清。目前常用的合成培養(yǎng)基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199培養(yǎng)液等。合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 合成培養(yǎng)基(液) 基本成分 合成培養(yǎng)基的種類雖多,但一般均含有氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)離子和一些其他的輔助成分。 隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和細(xì)

41、胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人工合成培養(yǎng)基不僅品種增加，配方相對固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養(yǎng)基成分趨于簡單化。 現(xiàn)今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養(yǎng)液比以前已有了較大改進(jìn)，增減了一些成分，以滿足細(xì)胞培養(yǎng)中新技術(shù)的需要。如雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培養(yǎng)基，使用時(shí)需補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA合成，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5mL。PHA有市售的商品。合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 人工合成培養(yǎng)基的優(yōu)

42、點(diǎn) 人工培養(yǎng)基是用已知成分配制，培養(yǎng)條件一致。 它可以精密地測定培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實(shí)驗(yàn)條件下不同組織細(xì)胞的生長和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細(xì)胞生長的更趨簡化的培養(yǎng)基。 用人工培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞比較透明清楚，胞漿內(nèi)的顆粒很少，換液時(shí)間可適當(dāng)延長，從而節(jié)省人力、物力。 人工合成培養(yǎng)基克服了天然培養(yǎng)基中可能潛在病毒污染的缺點(diǎn)，有利于培養(yǎng)和研究病毒。 培養(yǎng)基成分便于儲存和大量配制，便于細(xì)胞大量生產(chǎn)。合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 合成培養(yǎng)基種類已有幾十種。 199培養(yǎng)液培養(yǎng)液 是第一個(gè)

43、合成培養(yǎng)基于1950年問世，它含69種成分(見教材P43-45)，幾乎包括了所有的氨基酸、維生素和一些核酸衍生物、生長激素、脂類，加上硝酸鐵和生理鹽溶液，此較為復(fù)雜的合成培養(yǎng)液僅能短時(shí)間維持各類細(xì)胞的生長，只有加了血清之后才能作為生長培養(yǎng)基。199成分復(fù)雜，最近已不大使用。常用合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: Eagle培養(yǎng)基培養(yǎng)基(DMEM) 常用的是MEM (Minimum Eagle Medium，低限量培養(yǎng)基)，僅含12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素，成分簡單，適合各種已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)，同時(shí)宜于添加或減少某些成分，也特別適于特

44、殊研究的細(xì)胞培養(yǎng)工作。在它的基礎(chǔ)上改良的 DMEM(Dulbeccos modified Eagle medium， Dulbecco改良的 Eagle培養(yǎng)基）應(yīng)用也十分廣泛。 DMEM增加了各成分的用量(雙倍)，葡萄糖用量可選擇低糖(1000mg/L)或高糖(4500mg/L)，對于生長速度較快，附著性較差的腫瘤細(xì)胞生長有利。特別應(yīng)用在附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點(diǎn)的克隆培養(yǎng)時(shí)，采用高糖的培養(yǎng)液效果較好。常用于雜交瘤技術(shù)中骨髓瘤細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。常用合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: RPMl-l640 是一種常用的

45、培養(yǎng)液，最初是針對淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，問世后發(fā)現(xiàn)能廣泛適應(yīng)許多種類的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，而且成分簡單，和MEM一樣應(yīng)用十分廣泛。 F12培養(yǎng)基培養(yǎng)基 F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含多種微量元素，最初設(shè)計(jì)用于克隆二倍體的中國地鼠卵巢細(xì)胞。起初是作為一種無血清配方設(shè)計(jì)的，現(xiàn)常補(bǔ)加血清用于支持各種正常的和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖。F12常和DMEM以1：1結(jié)合，稱為DME/F12培養(yǎng)基(DME/F12medium)，作為開發(fā)無血清配方的基礎(chǔ)，以利用F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營養(yǎng)成分的優(yōu)點(diǎn)。常用合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail

46、: 常用合成培養(yǎng)基（液） 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 人工合成培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，稱為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因它提供細(xì)胞生存所需的營養(yǎng)成分，還稱為細(xì)胞營養(yǎng)液。人工合成培養(yǎng)基有干粉型、1倍工作液型和10倍濃縮型。常用的干粉型培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲存和運(yùn)輸，使用方便。 使用時(shí)按照說明書要求配制，要確保營養(yǎng)液所有組分完全溶解，并在消毒和保存過程中不產(chǎn)生沉淀。 下面以RPMI-1640培養(yǎng)液為例，簡介配制方法。合成培養(yǎng)基(液)的配制 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液 甲液：RPMI-1640

47、10.4g, Hepes 2.75.4g, 三蒸水 700ml,磁力攪拌至顆粒完全溶解(34h，橙黃色)。 乙液：NaHCO3 2.0 2.2g, 三蒸水 30ml。 37，30min顆粒溶解。 將甲、乙兩液混合，加水至終體積1000ml，在4靜止23h。濾過除菌，分裝，抽樣做無菌試驗(yàn)，20凍存。 RPMI-1640血清細(xì)胞培養(yǎng)液 RPMI-1640基礎(chǔ)營養(yǎng)液 80ml滅活小牛血清 20ml青霉素、鏈霉素 各100U/ml, pH 7.1 7.2 。合成培養(yǎng)基(液)的配制 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 血清細(xì)胞培養(yǎng)基 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想

48、使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基，常用的是血清、谷氨酰胺等。 另外，為防止污染，培養(yǎng)液中還要添加一定量的抗菌素。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清、谷氨酰胺、抗菌素等物質(zhì)后，叫細(xì)胞培養(yǎng)基，也叫完全培養(yǎng)基。 細(xì)胞培養(yǎng)基按血清含量多少又分為兩種，即細(xì)胞生長培養(yǎng)基和細(xì)胞維持培養(yǎng)基。 合成培養(yǎng)基(液)的配制 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 細(xì)胞用液的分裝要求細(xì)胞用液的分裝要求 行嚴(yán)格無菌操作。盡量減少試劑在空氣中的暴露時(shí)間。 根據(jù)配量準(zhǔn)備分裝瓶和瓶塞，分裝瓶規(guī)格、數(shù)量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備。避免因包裝瓶過大、貯 液時(shí)間過長或反復(fù)凍融使用造成營養(yǎng)成分丟失和微生物污染。按一次

49、用量或一周內(nèi)用量挑選小 包裝瓶。融化后的液體置4保存。 分裝前做好分裝量標(biāo)記，分裝瓶內(nèi)液體量要小于瓶容積的2/3。 做好分裝瓶標(biāo)記，包括試劑名稱、濃度、配制日期、組號。合成培養(yǎng)基(液)的配制 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 生長液與維持液:血清含有多種促進(jìn)細(xì)胞生長、貼附的活性物質(zhì)。合成培養(yǎng)基中不加血清或低濃度(如2）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長，這種培養(yǎng)基稱為維持液。 加入5的血清，對大多數(shù)細(xì)胞來說，能維持不死和緩慢生長。 一般需加入1020血清，有利于細(xì)胞生長，稱為生長液。 添加血清，雖利于細(xì)胞生長，但不明成分也增多了，對分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困

50、難。人們正在探索不用血清的無血清培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基(液)的配制 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基無血清細(xì)胞培養(yǎng)基 血清中究竟哪些成分是細(xì)胞生長所必需的呢?幾十年來沒有明確答案。還有一些細(xì)胞在血清培養(yǎng)基中不能生長。另外，由于血清成分復(fù)雜，常常給細(xì)胞培養(yǎng)后的研究工作，如細(xì)胞產(chǎn)物的提取、激素和藥物作用機(jī)理的研究帶來困難。 1975年，Sato成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株CH4，還有人用HamF12無血清細(xì)胞培養(yǎng)基成功地克隆了CHO細(xì)胞。 近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系(株)在無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中成功地生長和增殖，這些細(xì)胞有內(nèi)分泌細(xì)胞、表皮

51、細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎細(xì)胞等。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定 McAb、淋巴因子、干擾素等細(xì)胞產(chǎn)物的程序，降低疫苗反應(yīng)。無血清培養(yǎng)基(液) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 無血清培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基:必須根據(jù)不同的培養(yǎng)細(xì)胞選用合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MEM、NT、M199、F12、DMEM、RPMI-1640、IMDM、DMEM：F121：1、RPMI-1640：DMEM：F12=2：1：1等，其中DMEM和F12混合培養(yǎng)液

52、為多種細(xì)胞使用，根據(jù)不同細(xì)胞的要求，每升中補(bǔ)加Hepes 15mmol，NaHCO3 1.22.4克。 無血清培養(yǎng)基的補(bǔ)充成分:補(bǔ)充成分即代替血清的各種因子的總稱。多數(shù)無血清培養(yǎng)液必須補(bǔ)加38種因子，任何單一因子不能取代血清，至少需兩種。已知有100多種此類因子，其中有些是必需補(bǔ)充因子，如胰島素、硒酸鈉(Na2SeO3)和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其它多數(shù)為輔助作用因子。補(bǔ)充成分按功能將其分成四類。 無血清培養(yǎng)基(液) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 激素和生長因子激素和生長因子: 很多細(xì)胞用無血清培養(yǎng)時(shí)需加入激素，如胰島素(Ins)、生長激素、胰高血糖素等。此外，甾體激

53、素如孕酮、氫化可的松、雌二醇等也是無血清細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常用的補(bǔ)充因子。 每種細(xì)胞至少有23種生長因子對其正常生存和增殖起著調(diào)節(jié)作用，因此估計(jì)機(jī)體中約有100多種生長因子。按結(jié)構(gòu)和功能可分為表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等。生長因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細(xì)胞倍增時(shí)間。 無血清培養(yǎng)基(液) 結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白:結(jié)合蛋白有兩種，一種是轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)，它能增強(qiáng)細(xì)胞攝取和利用培養(yǎng)液中鐵的能力，還可結(jié)合毒性金屬離子，不同細(xì)胞需要量不同。另一種是白蛋白，它與脂類、金屬離子、激素等結(jié)合后，具有刺激細(xì)胞增殖作用。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保

54、勝 E-mail: 貼壁因子貼壁因子 絕大多數(shù)真核細(xì)胞在體外生長時(shí)需要固著于適當(dāng)?shù)幕?，幫助?xì)胞固著貼附的物質(zhì)叫貼壁因子或胞外基質(zhì)。體外培養(yǎng)細(xì)胞常于粘著斑(adhension plaque)或其近旁發(fā)現(xiàn)纖黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)，此處質(zhì)膜下正是紐帶蛋白(vinculin)及-輔助肌動蛋白(-actin)存在部位。肌動蛋白絲借助這兩種蛋白質(zhì)附著于質(zhì)膜的內(nèi)表面。FN又與非膠原糖蛋白相連。膜上FN受體將細(xì)胞外基質(zhì)FN與細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白絲相連。 這樣，胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜受體及細(xì)胞內(nèi)某些分子直接或間接作用，共同形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的統(tǒng)一體，成為控制細(xì)胞形態(tài)、功能、生長、分化以及某些其它性質(zhì)(如

55、影響質(zhì)膜中蛋白質(zhì)的組織等)的重要因素之一。如體外培養(yǎng)的神經(jīng)元存活及分化主要決定于所提供的細(xì)胞外基質(zhì)；肌細(xì)胞分化，肝細(xì)胞和乳腺細(xì)胞的形態(tài)、代謝，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，都與ECM有關(guān)。 無血清培養(yǎng)基(液) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 微量元素微量元素 微量元素對細(xì)胞長期傳代的作用于1981年由Murakam首先報(bào)道。硒元素不僅具有抗過氧化物酶對細(xì)胞的毒副作用，還可促進(jìn)細(xì)胞生長。1983年Clereand用一組復(fù)雜的微量元素，使8株雜交瘤細(xì)胞生長繁殖。 酶抑制劑 實(shí)驗(yàn)證實(shí)長期使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，會改變細(xì)胞的某些特性。是因?yàn)樵诩?xì)胞傳代時(shí)，常需借助酶的作

56、用，無血清培養(yǎng)基缺乏對細(xì)胞保護(hù)的成分，殘余的酶會對細(xì)胞造成損傷，因此無血清培養(yǎng)基內(nèi)必須添加酶抑制劑以中止殘余酶的作用。目前常用的是大豆胰酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)，使用濃度為0.10.5，濾過除菌后，將其加在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)。 目前無血清細(xì)胞培養(yǎng)基仍處在探索階段，尚無固定配方。無血清培養(yǎng)基(液) 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: pH調(diào)整液調(diào)整液:合成培養(yǎng)基大都呈弱酸性，而細(xì)胞生長的最適pH為7.07.2，可忍耐的pH范圍6.67.8。pH到7.6時(shí)，細(xì)胞雖有代謝但不再分裂增殖，故使用培養(yǎng)基時(shí)要調(diào)整pH，并注意

57、培養(yǎng)過程中的pH變化以及時(shí)換液。常用的pH調(diào)整液是NaHCO3、HEPES等。細(xì)胞培養(yǎng)用液-其他溶液 NaHCO3溶液:常用的濃度有 7.4、5.6、 3.7。 HEPES:為了較長時(shí)間恒定pH，可使用緩沖能力較強(qiáng)HEPES（N2oxyethylpiperazine N-2-ethanesulfonic acid，N- 2-羥乙基派嗪- N- 2-乙磺酸），使用的終濃度為1050mmol/L，可以根據(jù)緩沖能力的要求而定。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 抗生素液抗生素液:常用的有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、二性霉素等。常配成100 或200 于使用

58、濃度的鹽溶液內(nèi)，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養(yǎng)液內(nèi)，每小瓶最好一次用完。 細(xì)胞培養(yǎng)用液-其他溶液 L-Glutamin(谷氨酸)溶液制備 L-Glutamin(分子量146.15) 6g 三蒸水 200ml 濾過除菌；分裝；20保存； 使用時(shí)每100ml培養(yǎng)液加 l ml。 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: ( (一一) )原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng) 原代培養(yǎng)（原代培養(yǎng)（primary culture）從動物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長。 細(xì)胞株（細(xì)胞株（cell strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出

59、的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。 細(xì)胞系（細(xì)胞系（cell line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖 克隆（克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。 二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 原代細(xì)胞培養(yǎng)方法與步驟原代細(xì)胞培養(yǎng)方法與步驟 取材取材 消化與分散組織消化與分散組織 離心和計(jì)數(shù)離心和計(jì)數(shù) 接種培養(yǎng)接種培養(yǎng) 觀察觀察 單層細(xì)胞培養(yǎng)法（見錄像見錄像）和組織塊培養(yǎng)法。 細(xì)胞換液細(xì)胞換液：全量換液和半量換液。換液時(shí)機(jī)的選擇：培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多， pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)。二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法二、細(xì)胞培養(yǎng)的方法 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 上頁基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 楊保勝 E-mail: 鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng) 取材取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個(gè)孕鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，