細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析

1、細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定法試驗(yàn)講義講解 董光宴 1、光度測(cè)定法概述 2、試劑和儀器 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線 4、干擾試驗(yàn) 5、檢查法 湛江博康海洋生物有限公司一、光度測(cè)定法概述1 1、定量法的概念2、定量法的分類(lèi)3、定量法的原理1 定量法的概念 光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法： 濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。 定量法濁度法顯色基質(zhì)法動(dòng)態(tài)濁度法終點(diǎn)濁度法2 定量法分類(lèi)3 定量法的原理（1）動(dòng)力學(xué)曲線：細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)

2、過(guò)程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，混合物會(huì)逐漸變混濁，內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。（2）細(xì)菌內(nèi)毒素含量與時(shí)間的關(guān)系：細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對(duì)數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：LgT=a+bLgC 我們將這條直線稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）、數(shù)學(xué)原理 原理：OD=-Lg（It/Io） 0.02=-Lg（It/Io） It=95%Io二 試劑和儀器光度測(cè)定法鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：0907104，檢測(cè)限：0.015EU/ml；規(guī)格為1.25ml/支）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號(hào)：0908030，規(guī)格：2ml/

3、支）細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（200966，120EU/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）氯化鉀注射液（規(guī)格：1g/10ml 批號(hào)：0911211，生產(chǎn)廠家：河北某制藥廠） 細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)儀（生產(chǎn)單位：天大天發(fā)科技有限，型號(hào)：BET-72）三 標(biāo)準(zhǔn)曲線1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作4、標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件5、結(jié)果分析1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件l當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。l用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。 2 標(biāo)準(zhǔn)曲

4、線的選擇 制做標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點(diǎn)，也可選擇非等比系列點(diǎn)。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點(diǎn)，10倍等比系列點(diǎn)（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都受到一定限制；2倍等比系列點(diǎn)（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，但很不實(shí)用。我們推薦選用4倍 等 比 系 列 點(diǎn) （ 如 2 E U / m l 、 0 . 5 E U / m l 、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度適中，其相關(guān)系數(shù)

5、R和準(zhǔn)確性都較好，而且非常實(shí)用。3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶解稀釋 首先將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml圖 示3.2 定量法鱟試劑的溶解分裝 將復(fù)溶好的光度測(cè)定法鱟試劑分裝到14支定量分析專(zhuān)用試管中

6、，每管分裝0.1ml。定量法鱟試劑定量試管每管0.1ml3.3 加 樣 將內(nèi)毒素加入定量分析專(zhuān)用試管中，每個(gè)濃度做3支平行管，剩下兩管加入BET水作為陰性對(duì)照，每管加樣量均為0.2ml 。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水注：產(chǎn)品名稱(chēng)：注：產(chǎn)品名稱(chēng)：有機(jī)玻璃試管架 用 途：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查定量法中用于擺放小試管。 特 點(diǎn)：有機(jī)玻璃材料可保護(hù)定量法小試管，避免定量法小試管被磨花而影響試驗(yàn)結(jié)果。3.4 檢 測(cè) 加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后將試管對(duì)應(yīng)插入已恒溫的定量檢測(cè)儀（37），儀器開(kāi)始自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。注：封口膜封口膜的優(yōu)

7、點(diǎn)規(guī)規(guī) 格：格：4IN35FT（4英寸35英尺）特特 點(diǎn)：點(diǎn)：進(jìn)口代銷(xiāo) ，比較適合用于定量法專(zhuān)用試管的封口，清洗時(shí)不留任何殘留物。 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件l當(dāng)陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。l根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。l平行管的變異系數(shù)10%。5 結(jié)果分析 內(nèi)毒素 反應(yīng)時(shí)間變異系數(shù)實(shí)測(cè)內(nèi)毒素072000072002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.0

8、4%0.03180.032381 標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogT=2.9783-0.2621LogC，相關(guān)系數(shù)：=-0.9999,標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。四 干擾試驗(yàn)1、限值的確定2、干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算3、檢測(cè)濃度的選擇4、干擾試驗(yàn)溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗(yàn)的制備方法7、干擾試驗(yàn)加樣 8、判斷的標(biāo)準(zhǔn)9、試驗(yàn)結(jié)果分析 10、結(jié) 論1 限值的確定 2010版中國(guó)藥典二部正文1014頁(yè)【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg2 干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算 按照中國(guó)藥典2010年版提供的公式計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)（注：其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)為0.015EU/ml）。 最大有效稀釋倍數(shù)： MVD= CL/ =100

9、0.12/0.015 =800倍 3 檢測(cè)濃度的選擇 樣品限值表達(dá)方式為EU/ml，直接選用其無(wú)干擾濃度并填寫(xiě)相應(yīng)稀釋倍數(shù)即可；樣品限值表達(dá)方式為EU/mg ，無(wú)論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無(wú)干擾濃度并填寫(xiě)從1mg/ml開(kāi)始的相應(yīng)稀釋倍數(shù)，這樣檢測(cè)結(jié)果即為樣品每ml或mg中內(nèi)毒素的量。 我們將檢測(cè)結(jié)果直接與限值比較即可。4 干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度 被加入內(nèi)毒素的溶液 平行管數(shù)A無(wú)1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的0.5EU/ml（設(shè)為 m） 1.0mg/ml或0.5mg/ml 至少2 C2.0EU/ml、 0

10、.5EU/ml、 0.125EU/ml 、0.03EU/ml四個(gè)濃度 檢查用水每一濃度至少2 D無(wú)檢查用水至少2 5 供試品溶液的稀釋 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無(wú)外源物質(zhì)的干擾。 10.0mg/ml 2.0mg/ml1.0mg/ml 0.5mg/ml 0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml 圖 示6 干擾試驗(yàn)的制備方法 取氯化鉀注射液的2.0mg/ml 、1.0mg/ml稀釋液分別加入四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取

11、0.3ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1.0EU/ml按下圖加入其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水加入其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)所需樣品溶液。氯化鉀注射液內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml圖 示7 干擾試驗(yàn)加樣 取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專(zhuān)用試管10支，每個(gè)濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)

12、各4支；另做2支陰性對(duì)照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后對(duì)應(yīng)插入定量檢測(cè)儀，儀器開(kāi)始采集數(shù)據(jù)。 0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑1mg/ml的加樣0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加樣0.2ml陰性對(duì)照?qǐng)D 示8 判斷的標(biāo)準(zhǔn) 按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/m100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。 圖 示回收率： R=(CS-Ct)/m100%=10

13、0%9 試驗(yàn)結(jié)果分析樣品氯化鉀注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml（即稀釋倍數(shù)為1)以9、10、11和12管為例，計(jì)算該濃度下的回收率（R）。 R=(CS-Ct)/m100% =（0.4654-0.0122）/0.5100% =90%注：如果檢測(cè)結(jié)果小于檢測(cè)限，計(jì)算回收率時(shí)以0計(jì)。 10 結(jié) 論 結(jié)論：依據(jù)2010版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，氯化鉀注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗(yàn)要求，對(duì)鱟試驗(yàn)沒(méi)有干擾。常規(guī)檢查選用其中任一濃度即可。 五 檢查法1 檢測(cè)濃度的選擇 如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二個(gè)濃度作為日常檢查的

14、濃度。2 試驗(yàn)有效條件試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效： l標(biāo)準(zhǔn)曲線要符合 “可靠性試驗(yàn)”中的要求；l計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；l陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間。 3 結(jié)果判斷 若供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。 六、光度測(cè)的特點(diǎn)1、定量?jī)x器取值方法2、定量法的特點(diǎn)3、動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法的比較濁度法取值法透光率反應(yīng)時(shí)間取值法T0.95光密度反應(yīng)時(shí)間取值法T0.02濁度反應(yīng)時(shí)間取值法T501 定量?jī)x器取值方法1.1 透光率反應(yīng)時(shí)間取值法T0.

15、95 在鱟試驗(yàn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)達(dá)到某一狀態(tài)的時(shí)刻有關(guān)，只要測(cè)出這一時(shí)間就可算出內(nèi)毒素的實(shí)際濃度，這一過(guò)程叫反應(yīng)時(shí)間取值方法。透光率反應(yīng)時(shí)間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反應(yīng)曲線與反應(yīng)產(chǎn)物的量呈非線性關(guān)系。1.2 光密度反應(yīng)時(shí)間取值法T0.02 光密度限值法預(yù)設(shè)一個(gè)光密度OD值，當(dāng)反應(yīng)曲線從開(kāi)始上升到預(yù)設(shè)值時(shí)經(jīng)理的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，此方法的優(yōu)點(diǎn)是時(shí)刻變化的OD值與反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關(guān)系呈線性，取OD值上升0.02作為預(yù)設(shè)點(diǎn)，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開(kāi)始快速變化的時(shí)期

16、，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時(shí)間。1.3 濁度反應(yīng)時(shí)間取值法T50 濁度-時(shí)間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法”，這種動(dòng)態(tài)濁度法必須求出濁度達(dá)到0.5的時(shí)間t50， t50與拐點(diǎn)極為接近，用該點(diǎn)代替拐點(diǎn)。 T50法很有優(yōu)勢(shì)，但要求每次鱟試驗(yàn)必須達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，否則無(wú)法獲得終末透光強(qiáng)度，無(wú)法測(cè)得完整的濁度曲線，也就求不出t50。該法的缺點(diǎn)：耗時(shí)太長(zhǎng)。2 定量法的特點(diǎn)（1）通過(guò)反應(yīng)曲線，直觀顯示鱟試劑的反應(yīng)過(guò)程；通過(guò)反應(yīng)曲線，考察樣品中的干擾。（2）快速、準(zhǔn)確測(cè)到樣品中的內(nèi)毒素含量，有利于藥品生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制；可以檢測(cè)臨床病人體液中的內(nèi)毒素含量，作為疾病診斷的依據(jù)。（3）操作簡(jiǎn)單、可靠性高。3 動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法的比較項(xiàng)目動(dòng)態(tài)濁度法凝膠法結(jié)果對(duì)結(jié)果的解釋更慎重。有兩倍的誤差反應(yīng)速度使用OD限值法，達(dá)到規(guī)定OD值即可結(jié)束試驗(yàn)。規(guī)定1小時(shí)。鱟試劑表 示制做標(biāo)準(zhǔn)曲線描述鱟試劑的檢測(cè)能力，檢測(cè)結(jié)果與最低檢測(cè)限無(wú)關(guān)。用靈敏度復(fù)核試驗(yàn)來(lái)標(biāo)定鱟試劑的靈敏度。項(xiàng)目動(dòng)態(tài)濁度法凝膠