《天然藥物分析》6章HPLC課件

1、1 中藥（天然藥物）分析中藥（天然藥物）分析 第六章第六章高效液相色譜法的應(yīng)用2l 高效液相色譜法具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)在：高效液相色譜法具有應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)在：l （1）HPLC不受試樣揮發(fā)性和相對(duì)分子質(zhì)量的限制，不受試樣揮發(fā)性和相對(duì)分子質(zhì)量的限制，可用于分離高沸點(diǎn)、相對(duì)分子量大、熱穩(wěn)定性差的可用于分離高沸點(diǎn)、相對(duì)分子量大、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物，還可用于各種離子的分離；有機(jī)化合物，還可用于各種離子的分離；l （2）HPLC不僅可利用被分離組分的極性差別，還不僅可利用被分離組分的極性差別，還可利用組分分子尺寸大小的差別、離子交換能力的可利用組分分子尺寸大小的差別、離子交換能力的差別

2、以及生物分子間親和力的差別進(jìn)行分離。它還差別以及生物分子間親和力的差別進(jìn)行分離。它還可以用多種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)于性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似可以用多種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)于性質(zhì)和結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，分離的可能性比氣相色譜法更大；的物質(zhì)，分離的可能性比氣相色譜法更大；l （3）HPLC易于收集流出物組分，可利用制備柱進(jìn)易于收集流出物組分，可利用制備柱進(jìn)行較大量的制備。行較大量的制備。3第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜的技術(shù)參數(shù)高效液相色譜的技術(shù)參數(shù) l一速率理論一速率理論l l 圖圖6-1是氣相色譜法和高效液相色譜法的是氣相色譜法和高效液相色譜法的H-曲線。由圖可見(jiàn)，曲線。由圖可見(jiàn)，兩者形狀明顯不同。兩者形狀明顯不同。

3、HPLC法接近一條直線，而氣相色譜法曲法接近一條直線，而氣相色譜法曲線中有一極小值。線中有一極小值。l 圖圖 6-1 GC和和HPLC的典型的典型H-曲線曲線 4l 在在HPLC中，由于流動(dòng)相是液相，影響柱效的因素與中，由于流動(dòng)相是液相，影響柱效的因素與GC不完全相同。因此，范第姆特方程（不完全相同。因此，范第姆特方程（H = A + B/ + C ）應(yīng)作修正。）應(yīng)作修正。 l 在范第姆特方程中，在范第姆特方程中，HPLC與與GC的渦流擴(kuò)散項(xiàng)完全的渦流擴(kuò)散項(xiàng)完全相同。相同。l HPLC的分子擴(kuò)散項(xiàng)是因同種組分分子由濃度大的分子擴(kuò)散項(xiàng)是因同種組分分子由濃度大的譜帶中心向濃度較低的兩邊擴(kuò)散所引起。

4、它與組的譜帶中心向濃度較低的兩邊擴(kuò)散所引起。它與組分分子的流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（分分子的流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（Dm）成正比，與流）成正比，與流動(dòng)相的平均線速（動(dòng)相的平均線速（）成反比。）成反比。 uDCuBmd 由于液相中擴(kuò)散系數(shù)要比氣相中小45個(gè)數(shù)量級(jí)，HPLC中該相對(duì)于譜帶擴(kuò)張的影響可以忽略不計(jì)。 5l HPLC的傳質(zhì)阻力是由組分在兩相間的傳的傳質(zhì)阻力是由組分在兩相間的傳質(zhì)過(guò)程實(shí)際上不能瞬間達(dá)到平衡而引起的，質(zhì)過(guò)程實(shí)際上不能瞬間達(dá)到平衡而引起的，其傳質(zhì)阻力相包括三項(xiàng)：固定相傳質(zhì)阻力其傳質(zhì)阻力相包括三項(xiàng)：固定相傳質(zhì)阻力（Hs），移動(dòng)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（），移動(dòng)流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hm）和滯）和滯留流動(dòng)相

5、傳質(zhì)阻力（留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力（Hsm），即），即: smmsuHHHC6l 氣相色譜法主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力；液相色譜氣相色譜法主要考慮固定相的傳質(zhì)阻力；液相色譜法與之不同，在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起主要作用的是流法與之不同，在整個(gè)傳質(zhì)過(guò)程中起主要作用的是流動(dòng)相傳質(zhì)阻力，特別是滯留流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力，因動(dòng)相傳質(zhì)阻力，特別是滯留流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力，因此，改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力是此，改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。l 以上各項(xiàng)可歸納為：以上各項(xiàng)可歸納為： 其中CdDm/u相實(shí)際上可以略去。于是，上式可簡(jiǎn)寫(xiě)為：HACu7l 要想提高液相色譜

6、法的柱效，必須用小而要想提高液相色譜法的柱效，必須用小而均勻的固定相顆粒且要填充均勻，以減小渦均勻的固定相顆粒且要填充均勻，以減小渦流擴(kuò)散和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力。流擴(kuò)散和流動(dòng)相傳質(zhì)阻力。l 改進(jìn)固定相的結(jié)構(gòu)，對(duì)于減小滯留流動(dòng)相改進(jìn)固定相的結(jié)構(gòu)，對(duì)于減小滯留流動(dòng)相傳質(zhì)阻力以及固定相傳質(zhì)阻力至關(guān)重要。傳質(zhì)阻力以及固定相傳質(zhì)阻力至關(guān)重要。l 此外，選用低黏度的流動(dòng)相（如甲醇、乙此外，選用低黏度的流動(dòng)相（如甲醇、乙腈等），也有利于減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。腈等），也有利于減小傳質(zhì)阻力，提高柱效。 8二柱外效應(yīng)二柱外效應(yīng) l 柱外效應(yīng)（柱外效應(yīng)（ extra column effect）是指色譜柱外）是指色譜柱

7、外的因素所引起的峰展寬，又稱柱外展寬。它分為柱的因素所引起的峰展寬，又稱柱外展寬。它分為柱前和柱后兩種。前和柱后兩種。l 1柱前展寬柱前展寬l 主要由進(jìn)樣引起。主要由進(jìn)樣引起。HPLC進(jìn)樣常采用兩種方式：進(jìn)樣常采用兩種方式：閥門(mén)進(jìn)樣，試樣由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，進(jìn)樣閥有死體閥門(mén)進(jìn)樣，試樣由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，進(jìn)樣閥有死體積，會(huì)引起峰的展寬；注射進(jìn)樣，將試樣注入液流積，會(huì)引起峰的展寬；注射進(jìn)樣，將試樣注入液流中，或注入填料頂端，進(jìn)樣器內(nèi)的死體積和進(jìn)樣時(shí)中，或注入填料頂端，進(jìn)樣器內(nèi)的死體積和進(jìn)樣時(shí)液體擾動(dòng)而引起的擴(kuò)散，均會(huì)引起峰的展寬。液體擾動(dòng)而引起的擴(kuò)散，均會(huì)引起峰的展寬。l 減小進(jìn)樣閥的死體積，或者將試

8、樣直接注射到填減小進(jìn)樣閥的死體積，或者將試樣直接注射到填料頂端中心點(diǎn)或中心點(diǎn)以內(nèi)料頂端中心點(diǎn)或中心點(diǎn)以內(nèi)12mm處，可減少柱前處，可減少柱前的擴(kuò)散，使柱效顯著提高。的擴(kuò)散，使柱效顯著提高。 92柱后展寬柱后展寬 l 是由接管和檢測(cè)器流通池以及檢測(cè)器響應(yīng)是由接管和檢測(cè)器流通池以及檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間等因素引起。流動(dòng)相在接管中心流速較時(shí)間等因素引起。流動(dòng)相在接管中心流速較大，而管壁附近流速較慢，管中心處組分比大，而管壁附近流速較慢，管中心處組分比管壁部分先到達(dá)檢測(cè)器，引起峰的展寬。因管壁部分先到達(dá)檢測(cè)器，引起峰的展寬。因此盡可能用短的接管，減少流通池體積，可此盡可能用短的接管，減少流通池體積，可以提高柱

9、效。以提高柱效。l 檢測(cè)器、放大器和記錄儀響應(yīng)較慢，也會(huì)檢測(cè)器、放大器和記錄儀響應(yīng)較慢，也會(huì)使描繪的色譜峰寬增加，峰高降低，對(duì)于保使描繪的色譜峰寬增加，峰高降低，對(duì)于保留值較小的組分影響尤為突出。所以，改進(jìn)留值較小的組分影響尤為突出。所以，改進(jìn)檢測(cè)器和記錄系統(tǒng)的響應(yīng)速度也是克服柱后檢測(cè)器和記錄系統(tǒng)的響應(yīng)速度也是克服柱后展寬的一個(gè)途徑。展寬的一個(gè)途徑。 10三分離度三分離度 l 色譜法的關(guān)鍵問(wèn)題之一，就是難分離組分的分離色譜法的關(guān)鍵問(wèn)題之一，就是難分離組分的分離問(wèn)題。前已提出，有效塔板數(shù)（問(wèn)題。前已提出，有效塔板數(shù)（neff），是評(píng)價(jià)柱效），是評(píng)價(jià)柱效應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)，相對(duì)保留值（應(yīng)的一項(xiàng)指標(biāo)，相對(duì)

10、保留值（ris）是衡量色譜柱選）是衡量色譜柱選擇性的另一項(xiàng)指標(biāo)。但這兩項(xiàng)指標(biāo)未能說(shuō)明難分離擇性的另一項(xiàng)指標(biāo)。但這兩項(xiàng)指標(biāo)未能說(shuō)明難分離組分的真實(shí)分離效果。組分的真實(shí)分離效果。l 氣相色譜的分離效果可直接表現(xiàn)在色譜的峰間距氣相色譜的分離效果可直接表現(xiàn)在色譜的峰間距離和峰寬上，只有相鄰兩個(gè)色譜峰的距離較大、峰離和峰寬上，只有相鄰兩個(gè)色譜峰的距離較大、峰寬較窄時(shí)，兩個(gè)組分才能得到良好的分離。寬較窄時(shí)，兩個(gè)組分才能得到良好的分離。l 綜合考慮保留值的差值與峰寬對(duì)柱效率的影響，綜合考慮保留值的差值與峰寬對(duì)柱效率的影響，常用分離度作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)，以判斷常用分離度作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)，以判

11、斷難分離物質(zhì)對(duì)在色譜柱中的分離情況。難分離物質(zhì)對(duì)在色譜柱中的分離情況。11l 分離度用分離度用R表示，其定義為：相鄰兩色譜表示，其定義為：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰寬平均值之峰保留值之差與兩組分色譜峰峰寬平均值之比值，即：比值，即：12l R越大，兩色譜峰距離越遠(yuǎn)，分離效果越好。越大，兩色譜峰距離越遠(yuǎn)，分離效果越好。R 1時(shí)兩峰有部分重疊；時(shí)兩峰有部分重疊；R =1，兩峰有，兩峰有98%的分離；的分離；R =1.5時(shí)，分離程度可達(dá)時(shí)，分離程度可達(dá)99.7%。當(dāng)。當(dāng)R =1.5時(shí)，為相鄰時(shí)，為相鄰兩峰完全分離標(biāo)志。兩峰完全分離標(biāo)志。l 為了找出影響分離度的主要因素，可由式（為了找出影

12、響分離度的主要因素，可由式（6-8），），推導(dǎo)出總分離效能方程式，即：推導(dǎo)出總分離效能方程式，即：l （6-9） l l 式中，式中， ：柱效相；：柱效相； ：柱選擇相；：柱選擇相； 容量因子相。容量因子相。l 13不同分離度比較Poor efficiencyModerate selectivityPoor efficiencyGood selectivityExcellent efficiencyPoor selectivityExcellent efficiencyModerate selectivityR = 1R = 1.5R = 0.5R = 414如何提高分離度如何提高分離度l 1

13、. 通過(guò)下列方法增加保留時(shí)間通過(guò)下列方法增加保留時(shí)間l （1）選擇合適的分離參數(shù)）選擇合適的分離參數(shù)l （2）增加色譜柱長(zhǎng)度）增加色譜柱長(zhǎng)度l （3）增加固定相濃度）增加固定相濃度l 2. 通過(guò)下列方法降低譜帶寬度通過(guò)下列方法降低譜帶寬度l （1）使用均一的載體）使用均一的載體 （2）仔細(xì)填充色譜柱）仔細(xì)填充色譜柱l （3）選擇粒度小載體）選擇粒度小載體 （4）優(yōu)化流速）優(yōu)化流速l （5）減少進(jìn)樣量）減少進(jìn)樣量l （6）降低系統(tǒng)死體積）降低系統(tǒng)死體積l （7）降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間）降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間15四系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)四系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) l （1）色譜柱的理論塔板數(shù)）色譜柱的理論塔板數(shù)n：按：

14、按n = 5.54（tR/W1/2）2 計(jì)計(jì)算色譜柱的理論塔板數(shù)算色譜柱的理論塔板數(shù) l （2）分離度）分離度R：定量分析時(shí)，要求定量峰與其他峰：定量分析時(shí)，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般R1.5。l （3）重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣）重復(fù)性：取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于次，峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0l （4）拖尾因子）拖尾因子T：拖尾因子計(jì)算公式：拖尾因子計(jì)算公式 T=W0.05h/2d1l T應(yīng)在應(yīng)在0.951.05之間。之間。 16第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)技

15、術(shù)高效液相色譜的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 高效液相色譜進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器 17l一色譜系統(tǒng)一色譜系統(tǒng) l 1. 高壓泵高壓泵l 高壓泵是輸液系統(tǒng)最重要的部件。高壓泵是輸液系統(tǒng)最重要的部件。l 理想的泵應(yīng)當(dāng)是：理想的泵應(yīng)當(dāng)是：l （1）輸出流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，且有較大的可調(diào)范圍；）輸出流量恒定，無(wú)脈動(dòng)，且有較大的可調(diào)范圍；l （2）輸出壓力高而且平穩(wěn)；）輸出壓力高而且平穩(wěn)；l （3）死體積小，便于迅速更換溶劑和采用梯度洗脫；）死體積小，便于迅速更換溶劑和采用梯度洗脫；l （4）耐腐蝕，保養(yǎng)維修簡(jiǎn)便，壽命長(zhǎng)。）耐腐蝕，保養(yǎng)維修簡(jiǎn)便，壽命長(zhǎng)。l 18 2. 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置l HPLC有等度

16、洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式：前者保有等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫方式：前者保持流動(dòng)相組成配比不變；后者則在洗脫過(guò)程中連續(xù)持流動(dòng)相組成配比不變；后者則在洗脫過(guò)程中連續(xù)或階段的改變流動(dòng)相組成，它需要配有梯度洗脫裝或階段的改變流動(dòng)相組成，它需要配有梯度洗脫裝置。梯度洗脫裝置有兩類：置。梯度洗脫裝置有兩類：l （1）低壓梯度，又稱外梯度。先混合后加壓，即按）低壓梯度，又稱外梯度。先混合后加壓，即按一定程序在常壓下預(yù)先將溶劑混合后，再用泵加壓一定程序在常壓下預(yù)先將溶劑混合后，再用泵加壓輸入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是只需一臺(tái)泵，價(jià)廉。輸入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是只需一臺(tái)泵，價(jià)廉。l （2）高壓梯度，又稱內(nèi)梯度。先加壓，后混合

17、，即）高壓梯度，又稱內(nèi)梯度。先加壓，后混合，即用幾臺(tái)泵分別將不同溶劑加壓，按程序規(guī)定的流量用幾臺(tái)泵分別將不同溶劑加壓，按程序規(guī)定的流量比例輸入混合室混合，再使之進(jìn)入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)比例輸入混合室混合，再使之進(jìn)入色譜柱。其優(yōu)點(diǎn)是方便，能得到任意類型的梯度曲線，易于自動(dòng)化；是方便，能得到任意類型的梯度曲線，易于自動(dòng)化；但至少需兩臺(tái)泵，價(jià)格較高。但至少需兩臺(tái)泵，價(jià)格較高。 19 4. 色譜柱色譜柱l 色譜柱是色譜柱是HPLC最重要的部件，由柱管和固定相構(gòu)成。最重要的部件，由柱管和固定相構(gòu)成。它的作用是分離。它的作用是分離。l HPLC的色譜柱管通常為內(nèi)壁拋光的不銹鋼管，形狀的色譜柱管通常為內(nèi)壁拋光的不

18、銹鋼管，形狀幾乎全為直形。近年來(lái)由于微粒填料和高壓勻漿裝幾乎全為直形。近年來(lái)由于微粒填料和高壓勻漿裝柱技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了柱效。柱技術(shù)的應(yīng)用，大大提高了柱效。l 所用色譜柱都比較短（所用色譜柱都比較短（530cm），柱內(nèi)徑根據(jù)需要），柱內(nèi)徑根據(jù)需要而異；一般分析柱，內(nèi)徑而異；一般分析柱，內(nèi)徑45mm：凝膠色譜柱，內(nèi)：凝膠色譜柱，內(nèi)徑徑312mm；制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)；制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。以上。 205. 檢測(cè)器檢測(cè)器 l （1）紫外）紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器可見(jiàn)光檢測(cè)器l l 有固定波長(zhǎng)型和可調(diào)波長(zhǎng)型兩類有固定波長(zhǎng)型和可調(diào)波長(zhǎng)型兩類 。紫外檢。紫外檢測(cè)器靈敏度較高，但要求試樣必須有紫

19、外吸測(cè)器靈敏度較高，但要求試樣必須有紫外吸收，而且溶劑必須能透過(guò)所選波長(zhǎng)的光，選收，而且溶劑必須能透過(guò)所選波長(zhǎng)的光，選擇的波長(zhǎng)不能低于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。擇的波長(zhǎng)不能低于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。21 紫外可見(jiàn)檢測(cè)器I0 = 入射光強(qiáng)度I = 透射光強(qiáng)度A = 吸光度 a = 摩爾吸光系數(shù)b = 檢測(cè)池長(zhǎng)度c = 溶質(zhì)濃度IICboDetector CellLog = A = abcI0I22（2）光電二極管陣列檢測(cè)器（）光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）l 是是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道的檢測(cè)器，在晶年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道的檢測(cè)器，在晶體硅上緊密排列一系列的光電二極管，二極管越多體硅上緊密排列一系

20、列的光電二極管，二極管越多分辨率越高。一般是一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)的接受光譜上分辨率越高。一般是一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)的接受光譜上一個(gè)納米譜帶寬的單色光。一個(gè)納米譜帶寬的單色光。l 二極管陣列檢測(cè)器的工作原理是復(fù)光通過(guò)流動(dòng)池二極管陣列檢測(cè)器的工作原理是復(fù)光通過(guò)流動(dòng)池時(shí)，被組分選擇性的吸收，再進(jìn)入單色器，照射在時(shí)，被組分選擇性的吸收，再進(jìn)入單色器，照射在二極管陣列裝置上，使每個(gè)納米波長(zhǎng)的光強(qiáng)變成相二極管陣列裝置上，使每個(gè)納米波長(zhǎng)的光強(qiáng)變成相應(yīng)的電信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)的處理，從而獲得三應(yīng)的電信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)的處理，從而獲得三維光譜維光譜色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜色譜圖。吸收光譜用于組分的定性，色譜峰

21、用于定量，在中藥成分的研究中有廣泛的應(yīng)用。峰用于定量，在中藥成分的研究中有廣泛的應(yīng)用。23定性分析定性分析-峰純度檢驗(yàn)峰純度檢驗(yàn)pureimpure7.67.88.08.28.4Time (min)200400Wavelength (nm)Purity Match 764200400Wavelength (nm)Purity Match 999AbsorbanceAbsorbance24l （3）示差折光率檢測(cè)器（）示差折光率檢測(cè)器（differential refractive index detector）l 利用流動(dòng)相中出現(xiàn)試樣組分時(shí)引起折光率利用流動(dòng)相中出現(xiàn)試樣組分時(shí)引起折光率的變化進(jìn)

22、行檢測(cè)的。的變化進(jìn)行檢測(cè)的。l 示差折光率檢測(cè)器是通用型的，可對(duì)所有示差折光率檢測(cè)器是通用型的，可對(duì)所有溶質(zhì)都響應(yīng)，其缺點(diǎn)是不能用于梯度洗脫，溶質(zhì)都響應(yīng)，其缺點(diǎn)是不能用于梯度洗脫，且靈敏度較低。由于折光率隨溫度變化，示且靈敏度較低。由于折光率隨溫度變化，示差折光率檢測(cè)器必須控制恒溫，一般用于無(wú)差折光率檢測(cè)器必須控制恒溫，一般用于無(wú)紫外吸收物質(zhì)分析。紫外吸收物質(zhì)分析。 25l （4）熒光檢測(cè)器）熒光檢測(cè)器 l 主要特點(diǎn)是高靈敏度，高選擇性，樣品用量少。但主要特點(diǎn)是高靈敏度，高選擇性，樣品用量少。但相當(dāng)多的物質(zhì)不產(chǎn)生熒光，其應(yīng)用受到一定限制。相當(dāng)多的物質(zhì)不產(chǎn)生熒光，其應(yīng)用受到一定限制。l （5）電

23、化學(xué)檢測(cè)器（）電化學(xué)檢測(cè)器（electrochemical detector）l 電極活性組分流進(jìn)檢測(cè)器即發(fā)生電解，產(chǎn)生的電流電極活性組分流進(jìn)檢測(cè)器即發(fā)生電解，產(chǎn)生的電流經(jīng)放大而被檢測(cè)。非電極活性物質(zhì)不干擾測(cè)定，因經(jīng)放大而被檢測(cè)。非電極活性物質(zhì)不干擾測(cè)定，因而選擇性很高。檢出限達(dá)而選擇性很高。檢出限達(dá)pg級(jí)。級(jí)。 （6）電導(dǎo)檢測(cè)器（）電導(dǎo)檢測(cè)器（conductivity detector） 是離子色譜法應(yīng)用最多的檢測(cè)器。是離子色譜法應(yīng)用最多的檢測(cè)器。 對(duì)于分子不響應(yīng)，對(duì)于離子則是通用型的。電導(dǎo)對(duì)于分子不響應(yīng)，對(duì)于離子則是通用型的。電導(dǎo)檢測(cè)器要求溫度恒定，需放在恒溫箱中。雙示差電檢測(cè)器要求溫度恒

24、定，需放在恒溫箱中。雙示差電導(dǎo)檢測(cè)器消除了溫度變化的影響，可測(cè)定導(dǎo)檢測(cè)器消除了溫度變化的影響，可測(cè)定10-9mol/L的陰離子，也可編程控制溫度。的陰離子，也可編程控制溫度。 l 26l （7）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light-scatter detector， ELSD）l 是是90年代的通用型檢測(cè)器，對(duì)各種物質(zhì)幾乎同時(shí)年代的通用型檢測(cè)器，對(duì)各種物質(zhì)幾乎同時(shí)響應(yīng)，利用在一定的條件下粒子的數(shù)量不變，光散響應(yīng)，利用在一定的條件下粒子的數(shù)量不變，光散射強(qiáng)度正比于由溶質(zhì)決定的粒子的大小而進(jìn)行測(cè)量射強(qiáng)度正比于由溶質(zhì)決定的粒子的大小而進(jìn)行測(cè)量的。這就是：樣品結(jié)構(gòu)不

25、需要具備紫外發(fā)色團(tuán)和合的。這就是：樣品結(jié)構(gòu)不需要具備紫外發(fā)色團(tuán)和合適的折射率，對(duì)梯度洗脫和流動(dòng)相系統(tǒng)溫度變化不適的折射率，對(duì)梯度洗脫和流動(dòng)相系統(tǒng)溫度變化不敏感；對(duì)各種物質(zhì)的響應(yīng)因子很近；在一次的分析敏感；對(duì)各種物質(zhì)的響應(yīng)因子很近；在一次的分析中可以同時(shí)檢測(cè)主要成分和雜質(zhì)等。中可以同時(shí)檢測(cè)主要成分和雜質(zhì)等。27l 其工作原理是：將色譜柱流出液引入霧化器與通其工作原理是：將色譜柱流出液引入霧化器與通入的氣體混合形成均勻的微小液滴，經(jīng)過(guò)加熱的漂入的氣體混合形成均勻的微小液滴，經(jīng)過(guò)加熱的漂移管，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，而樣品組分形成氣溶膠，移管，蒸發(fā)除去流動(dòng)相，而樣品組分形成氣溶膠，然后進(jìn)入檢測(cè)器。用強(qiáng)光或激

26、光照射氣溶膠，產(chǎn)生然后進(jìn)入檢測(cè)器。用強(qiáng)光或激光照射氣溶膠，產(chǎn)生光散射，用光電二極管檢測(cè)散射光。光散射，用光電二極管檢測(cè)散射光。l 但是，其靈敏度比較低，尤其低于有紫外吸收的但是，其靈敏度比較低，尤其低于有紫外吸收的組分；此外，流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩組分；此外，流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽類。沖鹽類。282943.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractive IndexElectrochemicalConductivityMass specOthers檢測(cè)器使用統(tǒng)計(jì)檢測(cè)器使用統(tǒng)計(jì)30二色譜分離方式

27、二色譜分離方式 l （一）（一） 吸附色譜法吸附色譜法l 1原理原理l 吸附色譜法（吸附色譜法（absorption chromatography）又稱液固色）又稱液固色譜法（譜法（liquid-solid chromatography，LSC），它以固定吸），它以固定吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力。試樣分附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力。試樣分子（子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，它將與流動(dòng)相中的溶劑分子（）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，它將與流動(dòng)相中的溶劑分子（S）在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。l l 達(dá)到平衡時(shí)，有達(dá)到平衡時(shí)，有l(wèi) l 式中，式中，K：吸

28、附平衡常數(shù)。：吸附平衡常數(shù)。l K大的強(qiáng)極性組分易被吸附，保留值大，難于洗脫；大的強(qiáng)極性組分易被吸附，保留值大，難于洗脫；K小的小的弱極性組分難被吸附，保留值小，易于洗脫。因此，試樣中的弱極性組分難被吸附，保留值小，易于洗脫。因此，試樣中的各組分被分離。各組分被分離。 nSXnSX吸附吸附nnSXSXK吸附吸附312固定相固定相 l 吸附色譜法用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺吸附色譜法用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，以硅膠最為常用。硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線型容等，以硅膠最為常用。硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線型容量較高、機(jī)械性能較好、不溶脹，與大多數(shù)試樣不量較高、機(jī)械性能較好、不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生

29、化學(xué)反應(yīng)等。發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等。l 硅膠的吸附活性是由于硅膠表面的硅醇基產(chǎn)生的。硅膠的吸附活性是由于硅膠表面的硅醇基產(chǎn)生的。硅膠如吸附水，一部分硅醇基與水分子成氫鍵而失硅膠如吸附水，一部分硅醇基與水分子成氫鍵而失去活性，致使吸附力降低。升溫可以除去吸附劑里去活性，致使吸附力降低。升溫可以除去吸附劑里的水，使硅膠活化。但是溫度不可過(guò)高，否則會(huì)使的水，使硅膠活化。但是溫度不可過(guò)高，否則會(huì)使硅醇基脫去結(jié)構(gòu)水變成硅醚基，反而降低甚至失去硅醇基脫去結(jié)構(gòu)水變成硅醚基，反而降低甚至失去吸附力。通常將硅膠在吸附力。通常將硅膠在125150干燥干燥816h，干燥，干燥器中放冷后加入一定量的重蒸餾水調(diào)節(jié)活度，然后器中

30、放冷后加入一定量的重蒸餾水調(diào)節(jié)活度，然后裝柱。裝柱。323流動(dòng)相流動(dòng)相l(xiāng) 流動(dòng)相的選擇是影響流動(dòng)相的選擇是影響HPLC分離效果的主要因素。分離效果的主要因素。HPLC所用的流動(dòng)相又稱為洗脫劑（所用的流動(dòng)相又稱為洗脫劑（eluant）。）。l 吸附色譜法選擇流動(dòng)相的原則是：極性大的試樣吸附色譜法選擇流動(dòng)相的原則是：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣應(yīng)用極性較弱需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣應(yīng)用極性較弱的洗脫劑。洗脫劑的極性可用的洗脫劑。洗脫劑的極性可用Snyder提出的溶劑極提出的溶劑極性參數(shù)性參數(shù)P來(lái)表示。來(lái)表示。l 實(shí)際工作中常用混合溶劑作為洗脫劑，以改善分實(shí)際工作中常用混合溶劑

31、作為洗脫劑，以改善分離效果。離效果。l 在分離復(fù)雜試樣時(shí)，可按一定程序連續(xù)的或階段在分離復(fù)雜試樣時(shí)，可按一定程序連續(xù)的或階段的改變流動(dòng)相的組成，這就是梯度洗脫（的改變流動(dòng)相的組成，這就是梯度洗脫（gradient elution）。它類似于氣相色譜法中程序升溫所起的）。它類似于氣相色譜法中程序升溫所起的作用，能夠提高分離效率，改善峰形，加快分析速作用，能夠提高分離效率，改善峰形，加快分析速度。度。 33l流動(dòng)相的優(yōu)化流動(dòng)相的優(yōu)化l 優(yōu)化：指在合理的時(shí)間內(nèi)，所有的流動(dòng)相能優(yōu)化：指在合理的時(shí)間內(nèi)，所有的流動(dòng)相能使樣品各組分達(dá)到足夠的分離。使樣品各組分達(dá)到足夠的分離。l “選擇合適強(qiáng)度的溶劑是獲得分

32、離最佳化的選擇合適強(qiáng)度的溶劑是獲得分離最佳化的首要條件。首要條件?！?4l 選擇流動(dòng)相還要注意以下要求，這些要求也選擇流動(dòng)相還要注意以下要求，這些要求也適用于其它類型的適用于其它類型的HPLC： （1）不允許使用能引起柱損失或柱保留特性）不允許使用能引起柱損失或柱保留特性變化的溶劑。如吸附色譜的流動(dòng)相不應(yīng)含水，變化的溶劑。如吸附色譜的流動(dòng)相不應(yīng)含水，使用硅膠做填料的色譜柱不能使用堿性溶劑。使用硅膠做填料的色譜柱不能使用堿性溶劑。l （2）溶劑純度要高。使用前應(yīng)過(guò)濾，除去）溶劑純度要高。使用前應(yīng)過(guò)濾，除去塵埃微粒，以免堵塞，還應(yīng)除去溶解的氣體塵埃微粒，以免堵塞，還應(yīng)除去溶解的氣體（稱為脫氣），以

33、免在柱中或檢測(cè)器中產(chǎn)生（稱為脫氣），以免在柱中或檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡而影響分離和檢測(cè)。氣泡而影響分離和檢測(cè)。l 脫氣方式脫氣方式35l （3）溶劑對(duì)于試樣要有適量的溶解度，以）溶劑對(duì)于試樣要有適量的溶解度，以免試樣在柱中沉淀而造成堵塞。更換流動(dòng)相免試樣在柱中沉淀而造成堵塞。更換流動(dòng)相時(shí)必須保證互溶。時(shí)必須保證互溶。l （4）流動(dòng)相應(yīng)與檢測(cè)器匹配。如用紫外檢）流動(dòng)相應(yīng)與檢測(cè)器匹配。如用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相本身在檢測(cè)波長(zhǎng)處應(yīng)當(dāng)無(wú)吸測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相本身在檢測(cè)波長(zhǎng)處應(yīng)當(dāng)無(wú)吸收。收。l 溶劑的截止波長(zhǎng)溶劑的截止波長(zhǎng)l （5）盡量使用低粘度溶劑，如甲醇、乙腈）盡量使用低粘度溶劑，如甲醇、乙腈等可以提高柱效，還能

34、降低色譜柱的阻力。等可以提高柱效，還能降低色譜柱的阻力。 3637（二）分配色譜法（二）分配色譜法 l1原理原理l 分配色譜法（分配色譜法（partition chromatography）又 稱 液 液 色 譜 法 （又 稱 液 液 色 譜 法 （ l i q u i d - l i q u i d chromatography，LLC），是根據(jù)物質(zhì)在），是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶（或部分互溶）的液體中溶解兩種互不相溶（或部分互溶）的液體中溶解度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的度的不同，有不同的分配，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分，保留值也較大。方法。分配系數(shù)較大的組分，保留值也較

35、大。38l 根據(jù)固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)極性的大根據(jù)固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)極性的大小，可將分配色譜法分為兩類：小，可將分配色譜法分為兩類：l （1）流動(dòng)相極性低而固定相極性高的，稱）流動(dòng)相極性低而固定相極性高的，稱為 正 相 分 配 色 譜 法 （為 正 相 分 配 色 譜 法 （ n o r m a l p h a s e partition chromatography）。它對(duì)于極性）。它對(duì)于極性強(qiáng)的組分有較大的保留值，常用于分離強(qiáng)極強(qiáng)的組分有較大的保留值，常用于分離強(qiáng)極性化合物。性化合物。l （2）流動(dòng)相極性大于固定相的，稱為反相）流動(dòng)相極性大于固定相的，稱為反相分配色譜法（分配色譜法

36、（reversed phase partition chromatography）。它對(duì)于極性弱的組分）。它對(duì)于極性弱的組分有較大的保留值，適于分離弱極性的化合物。有較大的保留值，適于分離弱極性的化合物。392固定相固定相 l 化學(xué)鍵合相（化學(xué)鍵合相（chemically bonded phase）是利用）是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面，形成均一、化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。牢固的單分子薄層而構(gòu)成的。l 一般用硅膠作載體，采用的鍵合反應(yīng)有酯化鍵合一般用硅膠作載體，采用的鍵合反應(yīng)有酯化鍵合（Si-O-C型）、硅烷化鍵合（型）、硅烷化鍵合（Si-O

37、-Si-C型）和硅氮型）和硅氮鍵合（鍵合（Si-N型）等。型）等。l 其中，以硅烷化鍵合反應(yīng)最為常用其中，以硅烷化鍵合反應(yīng)最為常用 40l 化學(xué)鍵合相具有以下特點(diǎn)：化學(xué)鍵合相具有以下特點(diǎn)：l （1）固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命）固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高。較高。l （2）能耐各種溶劑，可用于梯度洗脫。）能耐各種溶劑，可用于梯度洗脫。l （3）表面較為均一，沒(méi)有液坑，傳質(zhì)快，）表面較為均一，沒(méi)有液坑，傳質(zhì)快，柱效高。柱效高。l （4）能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性，例）能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性，例如鍵合氰基、氨基等極性基團(tuán)用于正相色譜如鍵合氰基、氨基等極性基團(tuán)用于正相色譜法，鍵合

38、離子交換基團(tuán)用于離子色譜法等。法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法等。l 因此，它是因此，它是HPLC較為理想的固定相。較為理想的固定相。 41l 根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和可將鍵合相色譜法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。反相鍵合相色譜法。l （1）在正相鍵合相色譜法中，鍵合固定相）在正相鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。l （2）在反相鍵合相色譜法中，鍵合固定相）在反相

39、鍵合相色譜法中，鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適用于分離非極的極性小于流動(dòng)相的極性，適用于分離非極性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍比正性、極性或離子型化合物，其應(yīng)用范圍比正相鍵合相色譜法更廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相相鍵合相色譜法更廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相色譜法中，約色譜法中，約70%80%的分析任務(wù)是由反的分析任務(wù)是由反相鍵合相色譜法來(lái)完成的。相鍵合相色譜法來(lái)完成的。 423. 流動(dòng)相流動(dòng)相 l 分配色譜法所用流動(dòng)相的極性必須與固定相顯著不分配色譜法所用流動(dòng)相的極性必須與固定相顯著不同。選擇流動(dòng)相一般靠實(shí)驗(yàn)?？梢杂脝我坏娜軇?，同。選擇流動(dòng)相一般靠實(shí)驗(yàn)?？梢杂脝我坏娜軇?，更常用混合溶劑。正相色譜

40、法常用低極性溶劑如烴更常用混合溶劑。正相色譜法常用低極性溶劑如烴類，加入適量極性溶劑如氯仿、醇類以調(diào)節(jié)溶劑極類，加入適量極性溶劑如氯仿、醇類以調(diào)節(jié)溶劑極性參數(shù)性參數(shù) P，其溶劑系統(tǒng)的選擇與吸附色譜法相同。，其溶劑系統(tǒng)的選擇與吸附色譜法相同。反相色譜法中，溶劑的洗脫能力用溶劑強(qiáng)度因子反相色譜法中，溶劑的洗脫能力用溶劑強(qiáng)度因子( )表示，其大小順序與正相色譜的表示，其大小順序與正相色譜的P相反，通常以水相反，通常以水或無(wú)機(jī)鹽緩沖溶液為主體，加入甲醇、乙腈等調(diào)節(jié)或無(wú)機(jī)鹽緩沖溶液為主體，加入甲醇、乙腈等調(diào)節(jié)極性。極性。l 梯度洗脫時(shí)，正相色譜法通常逐漸增大洗脫劑中梯度洗脫時(shí)，正相色譜法通常逐漸增大洗脫

41、劑中極性溶劑的比例；而反相色譜法則與之相反，逐漸極性溶劑的比例；而反相色譜法則與之相反，逐漸增大極性相對(duì)較低的甲醇或乙腈的比例。增大極性相對(duì)較低的甲醇或乙腈的比例。 l 0434. 反相離子對(duì)色譜法反相離子對(duì)色譜法 l 離子對(duì)色譜法（離子對(duì)色譜法（ion pair chromatography）是）是20世紀(jì)世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來(lái)的。其中，反相年代中期發(fā)展起來(lái)的。其中，反相離子對(duì)色譜法應(yīng)用較多，它是在強(qiáng)極性的流離子對(duì)色譜法應(yīng)用較多，它是在強(qiáng)極性的流動(dòng)相中加入與被測(cè)離子電荷相反的平衡離子，動(dòng)相中加入與被測(cè)離子電荷相反的平衡離子，從而實(shí)現(xiàn)色譜分離的。常用的平衡離子試劑從而實(shí)現(xiàn)色譜分離的。常用的平

42、衡離子試劑有烷基磺酸鈉和季銨鹽兩類，前者適用于分有烷基磺酸鈉和季銨鹽兩類，前者適用于分離有機(jī)堿類和有機(jī)陽(yáng)離子，后者適用于分離離有機(jī)堿類和有機(jī)陽(yáng)離子，后者適用于分離有機(jī)酸類和有機(jī)陰離子。有機(jī)酸類和有機(jī)陰離子。 44（三）離子色譜法（三）離子色譜法 l 離子色譜法（離子色譜法（ion chromatography，IC）是由）是由經(jīng) 典 離 子 交 換 色 譜 法 （經(jīng) 典 離 子 交 換 色 譜 法 （ i o n e x c h a n g e chromatography，IEC）派生出來(lái)的。它們都是用）派生出來(lái)的。它們都是用能交換離子的材料（例如離子交換樹(shù)脂）作為固定能交換離子的材料（例如

43、離子交換樹(shù)脂）作為固定相，利用它與流動(dòng)相中試樣離子進(jìn)行可逆的離子交相，利用它與流動(dòng)相中試樣離子進(jìn)行可逆的離子交換來(lái)分離離子型化合物的方法。換來(lái)分離離子型化合物的方法。 l 1離子交換原理離子交換原理l 試樣中的離子與離子交換樹(shù)脂上的離子發(fā)生交換反試樣中的離子與離子交換樹(shù)脂上的離子發(fā)生交換反應(yīng)應(yīng)l 452離子交換色譜法的固定相和流動(dòng)相離子交換色譜法的固定相和流動(dòng)相 HPLC常用的離子交換填料有以下幾種：常用的離子交換填料有以下幾種：l （1）多孔樹(shù)脂：直徑為）多孔樹(shù)脂：直徑為1020m。其交換容量較。其交換容量較高，但有溶脹性，不耐高壓，而且表面微孔結(jié)構(gòu)影高，但有溶脹性，不耐高壓，而且表面微孔結(jié)

44、構(gòu)影響傳質(zhì)，柱效較低。響傳質(zhì)，柱效較低。l （2）薄層樹(shù)脂：即在）薄層樹(shù)脂：即在3040m直徑的玻珠表面涂直徑的玻珠表面涂一層離子交換樹(shù)脂。其柱效較高，耐壓，但交換容一層離子交換樹(shù)脂。其柱效較高，耐壓，但交換容量低。量低。l （3）離子性鍵合固定相：在硅膠基體表面鍵合離子）離子性鍵合固定相：在硅膠基體表面鍵合離子交換基團(tuán)而成，制成交換基團(tuán)而成，制成5或或10m直徑的全多孔微粒。直徑的全多孔微粒。它的機(jī)械性強(qiáng)度較高，化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，它的機(jī)械性強(qiáng)度較高，化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性較好，柱效高，交換容量能符合要求，較為理想。柱效高，交換容量能符合要求，較為理想。 46l 離子交換色譜法大多用一定

45、的離子交換色譜法大多用一定的pH和一定濃度的緩沖和一定濃度的緩沖液作為洗脫劑。液作為洗脫劑。l 分離有機(jī)酸堿時(shí)，洗脫劑的分離有機(jī)酸堿時(shí)，洗脫劑的pH影響酸堿的解離程度，影響酸堿的解離程度，因而影響因而影響k。最好將。最好將pH選擇在被分離的酸堿的選擇在被分離的酸堿的pKa附附近。緩沖液的離子強(qiáng)度也會(huì)影響近。緩沖液的離子強(qiáng)度也會(huì)影響k。一般來(lái)說(shuō)，離子。一般來(lái)說(shuō)，離子強(qiáng)度增大，即緩沖溶液濃度增大時(shí)，強(qiáng)度增大，即緩沖溶液濃度增大時(shí)，k減小。減小。l 對(duì)于多組分混合物的分離，可以采取改變離子強(qiáng)度對(duì)于多組分混合物的分離，可以采取改變離子強(qiáng)度或改變緩沖液或改變緩沖液pH兩種梯度洗脫方式。兩種梯度洗脫方式。

46、 473. 電導(dǎo)檢測(cè)雙柱離子色譜法電導(dǎo)檢測(cè)雙柱離子色譜法 l 離子交換色譜法現(xiàn)代化過(guò)程中遇到的一個(gè)難題是離子交換色譜法現(xiàn)代化過(guò)程中遇到的一個(gè)難題是離子的檢測(cè)。使用紫外、熒光等檢測(cè)器只能分析某離子的檢測(cè)。使用紫外、熒光等檢測(cè)器只能分析某些具有特殊性質(zhì)的離子。利用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)離子些具有特殊性質(zhì)的離子。利用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)離子具有通用性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但因洗脫劑中的離具有通用性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但因洗脫劑中的離子也有響應(yīng)而難以使用。離子色譜法的發(fā)明解決了子也有響應(yīng)而難以使用。離子色譜法的發(fā)明解決了這個(gè)難題，開(kāi)創(chuàng)了分離分析離子化合物的新局面。這個(gè)難題，開(kāi)創(chuàng)了分離分析離子化合物的新局面。l 雙柱離子色

47、譜法又稱抑制型離子色譜法。該法在雙柱離子色譜法又稱抑制型離子色譜法。該法在分離柱和電導(dǎo)檢測(cè)器之間增加了一根抑制柱分離柱和電導(dǎo)檢測(cè)器之間增加了一根抑制柱（suppressor column），柱中填充電荷與分離柱），柱中填充電荷與分離柱相反的離子交換樹(shù)脂。洗出液（相反的離子交換樹(shù)脂。洗出液（eluate），即分離），即分離柱流出的溶液，進(jìn)入抑制柱發(fā)生抑制反應(yīng)，除去洗柱流出的溶液，進(jìn)入抑制柱發(fā)生抑制反應(yīng)，除去洗脫劑離子，然后就入檢測(cè)器。脫劑離子，然后就入檢測(cè)器。l （1）陰離子分析）陰離子分析 （2）陽(yáng)離子分析）陽(yáng)離子分析 484電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色譜法電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色譜法 l 電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色

48、譜法又稱非抑制型離電導(dǎo)檢測(cè)單柱離子色譜法又稱非抑制型離子色譜法。它只用一根分離柱，不用抑制柱。子色譜法。它只用一根分離柱，不用抑制柱。由于減少了抑制柱帶來(lái)的死體積，分離效率由于減少了抑制柱帶來(lái)的死體積，分離效率高，且能用普通的高，且能用普通的HPLC儀改裝。該方法近儀改裝。該方法近年來(lái)發(fā)展更為迅速。年來(lái)發(fā)展更為迅速。l 單柱離子色譜法的基本原理是：?jiǎn)沃x子色譜法的基本原理是：l （1）采用了低濃度洗脫劑，降低洗出液的）采用了低濃度洗脫劑，降低洗出液的本底電導(dǎo)水平。本底電導(dǎo)水平。l （2）采用了低容量的離子交換樹(shù)脂，使保）采用了低容量的離子交換樹(shù)脂，使保留值保持不變。留值保持不變。49l 離子色

49、譜法具有靈敏度高、選擇性好、快離子色譜法具有靈敏度高、選擇性好、快速、能同時(shí)分析多種離子的優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)速、能同時(shí)分析多種離子的優(yōu)點(diǎn)，特別是對(duì)于陰離子的分離分析，在各種儀器分析方法于陰離子的分離分析，在各種儀器分析方法中堪稱首選方法。在檢測(cè)手段方面，除電導(dǎo)中堪稱首選方法。在檢測(cè)手段方面，除電導(dǎo)檢測(cè)器以外，還可用柱后衍生技術(shù)，使用其檢測(cè)器以外，還可用柱后衍生技術(shù)，使用其他類型的檢測(cè)器。為了防止微量金屬離子的他類型的檢測(cè)器。為了防止微量金屬離子的干擾，專用的離子色譜儀通常采用全塑結(jié)構(gòu)。干擾，專用的離子色譜儀通常采用全塑結(jié)構(gòu)。l 屬于離子色譜法的還有離子排斥色譜法屬于離子色譜法的還有離子排斥色譜法（

50、ICE）和流動(dòng)相離子色譜法（）和流動(dòng)相離子色譜法（MPIC）等，）等，可參閱有關(guān)專著?？蓞㈤営嘘P(guān)專著。 50（四）尺寸排阻色譜法（四）尺寸排阻色譜法 l 1原理原理l 尺寸排阻色譜法（尺寸排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC），又稱凝膠色譜法、凝），又稱凝膠色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法（膠過(guò)濾色譜法（gel filtration chromatography，GFC）、凝膠滲透色譜法（）、凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography，GPC）、空間排阻色譜法）、空間排阻色譜法l 它主要用于較大分子的分離。固定相為化學(xué)惰性它主要用

51、于較大分子的分離。固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)多孔物質(zhì) 凝膠，它不具有吸附、分配和離子交換凝膠，它不具有吸附、分配和離子交換作用。凝膠的孔徑與被分離組分分子大小相應(yīng)，當(dāng)作用。凝膠的孔徑與被分離組分分子大小相應(yīng)，當(dāng)試樣中大小不同的組分分子隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠顆粒試樣中大小不同的組分分子隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠顆粒時(shí)，它們滲入凝膠微孔的程度不同；大分子受排阻時(shí)，它們滲入凝膠微孔的程度不同；大分子受排阻不能進(jìn)入微孔，分子越小則進(jìn)入微孔越深，因而滯不能進(jìn)入微孔，分子越小則進(jìn)入微孔越深，因而滯留時(shí)間不同。試樣中的各組分按照分子大小順序洗留時(shí)間不同。試樣中的各組分按照分子大小順序洗脫脫 51522固定相和流動(dòng)相固定相和流

52、動(dòng)相 l 凝膠種類很多，按強(qiáng)度分軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)凝膠凝膠種類很多，按強(qiáng)度分軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)凝膠3類：類：l （1）軟質(zhì)凝膠，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，它們）軟質(zhì)凝膠，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠，它們適用于水作流動(dòng)相，具有較大的溶脹性，只能在常適用于水作流動(dòng)相，具有較大的溶脹性，只能在常壓下使用。壓下使用。l （2）半硬質(zhì)膠，如交聯(lián)聚苯乙烯，它們比軟質(zhì)膠稍）半硬質(zhì)膠，如交聯(lián)聚苯乙烯，它們比軟質(zhì)膠稍耐壓，是親油性的，宜用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。耐壓，是親油性的，宜用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。l （3）硬質(zhì)膠，如多孔硅膠，多孔玻璃等，它們可在）硬質(zhì)膠，如多孔硅膠，多孔玻璃等，它們可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。但

53、是，由于凝膠孔徑較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。但是，由于凝膠孔徑對(duì)于分離至關(guān)重要，用硬質(zhì)膠時(shí)仍應(yīng)注意壓強(qiáng)不宜對(duì)于分離至關(guān)重要，用硬質(zhì)膠時(shí)仍應(yīng)注意壓強(qiáng)不宜過(guò)高（過(guò)高（7Mpa），流速不宜過(guò)快（），流速不宜過(guò)快（1ml/min），而），而且只能緩緩增加，否則會(huì)影響凝膠孔徑和分離效果。且只能緩緩增加，否則會(huì)影響凝膠孔徑和分離效果。 53（五）親和色譜法（五）親和色譜法 l1原理原理l 親和色譜法（親和色譜法（affinity chromatography）是利用生物分子親和力進(jìn)行色譜分離的技術(shù)。是利用生物分子親和力進(jìn)行色譜分離的技術(shù)。生物中許多大分子化合物具有一種特性，能生物中許多大分子化合物具有一種特

54、性，能與結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的某種專一分子可逆地結(jié)合。例與結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的某種專一分子可逆地結(jié)合。例如酶與底物；抗原與抗體；激素與受體；如酶與底物；抗原與抗體；激素與受體；RNA與和它互補(bǔ)的與和它互補(bǔ)的DNA等。生物分子間的這等。生物分子間的這種結(jié)合力稱為親和力。種結(jié)合力稱為親和力。54l 該方法將可親和的一對(duì)分子的一方，即配該方法將可親和的一對(duì)分子的一方，即配基，通過(guò)間隔基手臂以共價(jià)鍵結(jié)合到載體上基，通過(guò)間隔基手臂以共價(jià)鍵結(jié)合到載體上作為固定相；而另一方面，即親和物則在試作為固定相；而另一方面，即親和物則在試樣中。當(dāng)含有親和物的復(fù)雜混合試樣隨流動(dòng)樣中。當(dāng)含有親和物的復(fù)雜混合試樣隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，親和物就與

55、配基結(jié)合而與相流經(jīng)固定相時(shí)，親和物就與配基結(jié)合而與其他組分分離。在其它組分洗脫之后，改變其他組分分離。在其它組分洗脫之后，改變條件以降低親和物與配基的親和力，或使間條件以降低親和物與配基的親和力，或使間隔基手臂斷裂，就能使被分離的物質(zhì)洗脫下隔基手臂斷裂，就能使被分離的物質(zhì)洗脫下來(lái)。來(lái)。l 親和色譜法特別適用于生物化學(xué)，可用于親和色譜法特別適用于生物化學(xué)，可用于各種酶、輔酶、激素和免疫球蛋白等生物分各種酶、輔酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分離。子的分離。 55圖圖 6-10 親和色譜法示意圖親和色譜法示意圖 562固定相固定相 l 親和色譜法的固定相又稱親和吸附劑，由載體和配親和色譜法的固定相

56、又稱親和吸附劑，由載體和配基（基（L）構(gòu)成。載體要求：）構(gòu)成。載體要求：l （1）具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易為大分子滲透。）具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，易為大分子滲透。l （2）具有相當(dāng)數(shù)量可供偶聯(lián)的集團(tuán)，能結(jié)合配基。）具有相當(dāng)數(shù)量可供偶聯(lián)的集團(tuán)，能結(jié)合配基。l （3）沒(méi)有吸附性，不發(fā)生非專一吸附。）沒(méi)有吸附性，不發(fā)生非專一吸附。l （4）均一，有一定硬度，性質(zhì)穩(wěn)定，親水等。）均一，有一定硬度，性質(zhì)穩(wěn)定，親水等。l 應(yīng)用最多的載體是瓊脂糖凝膠，商品名應(yīng)用最多的載體是瓊脂糖凝膠，商品名Sepharose或或Bio-Gel A。瓊脂糖凝膠在。瓊脂糖凝膠在pH49穩(wěn)定，通過(guò)交聯(lián)穩(wěn)定，通過(guò)交聯(lián)劑處理的凝膠適用范圍可擴(kuò)

57、大到劑處理的凝膠適用范圍可擴(kuò)大到pH312。其他常用。其他常用的載體還有聚丙烯酰胺載體、葡聚糖凝膠、多孔玻的載體還有聚丙烯酰胺載體、葡聚糖凝膠、多孔玻璃等。璃等。 573吸附與洗脫吸附與洗脫 l 親和色譜法的一般操作方法是：將親和吸親和色譜法的一般操作方法是：將親和吸附劑裝柱，用緩沖溶液平衡色譜柱，再將待附劑裝柱，用緩沖溶液平衡色譜柱，再將待分離的溶液過(guò)柱。為使親和物（分離的溶液過(guò)柱。為使親和物（X）能緊密）能緊密結(jié)合在配基上，應(yīng)選擇適當(dāng)結(jié)合在配基上，應(yīng)選擇適當(dāng)pH、離子強(qiáng)度和、離子強(qiáng)度和化學(xué)組成一定的平衡緩沖液，并控制適當(dāng)溫化學(xué)組成一定的平衡緩沖液，并控制適當(dāng)溫度。試樣上柱后，可用平衡緩沖液

58、或較高離度。試樣上柱后，可用平衡緩沖液或較高離子強(qiáng)度的溶液淋洗，以除去非專一吸附的雜子強(qiáng)度的溶液淋洗，以除去非專一吸附的雜質(zhì)。然后，進(jìn)行親和物的洗脫。質(zhì)。然后，進(jìn)行親和物的洗脫。58第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜的分析應(yīng)用高效液相色譜的分析應(yīng)用 l一樣品預(yù)處理和色譜柱保護(hù)一樣品預(yù)處理和色譜柱保護(hù) l （一）分析前樣品的處理（一）分析前樣品的處理 l 1柱污染來(lái)源柱污染來(lái)源l 2樣品預(yù)處理的方法樣品預(yù)處理的方法l 通常原則是處理的樣品極性范圍越窄越好，當(dāng)然通常原則是處理的樣品極性范圍越窄越好，當(dāng)然要保證待測(cè)組分的最大回收。要保證待測(cè)組分的最大回收。l ODS反相柱，要求最大程度去掉反相柱，要求最大程

59、度去掉k值大的脂溶性值大的脂溶性雜質(zhì)；雜質(zhì)；l 硅膠柱要最大程度去掉極性大即與硅膠吸附大的硅膠柱要最大程度去掉極性大即與硅膠吸附大的雜質(zhì)。雜質(zhì)。 59HPLC法測(cè)定延胡索中叔胺類生物堿的含量法測(cè)定延胡索中叔胺類生物堿的含量l 主要生物堿有主要生物堿有d-紫堇堿（紫堇堿（d-corydaline，即延胡索甲素）、，即延胡索甲素）、dl-四氫巴馬亭（四氫巴馬亭（dl-tetrahydropalmatine，即延胡索乙素）、，即延胡索乙素）、原鴉片堿（原鴉片堿（protopine，即延胡索丙素）、，即延胡索丙素）、l-四氫黃連堿（四氫黃連堿（l-tetrahydrocoptisine，即延胡索丁素）

60、、，即延胡索丁素）、dl-四氫黃連堿（即四氫黃連堿（即延胡索戊素）、延胡索戊素）、l-四氫非洲防已堿（四氫非洲防已堿（l-tetrahydrocolumnamine，即延胡索己素）、延胡索辛素，即延胡索己素）、延胡索辛素（corydalis H）、延胡索壬素（）、延胡索壬素（corydalis I）、延胡索癸素）、延胡索癸素（corydalis J）、延胡索子素（）、延胡索子素（corydalis K）、延胡索丑素）、延胡索丑素（corydalis L）、）、-別隱品堿（別隱品堿（-allocryptopine，即延胡，即延胡索寅素）、紫堇鱗莖堿（索寅素）、紫堇鱗莖堿（corybulbine，