豬塞內(nèi)卡病毒編制說明

1、豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定標準編制說明一、任務來源、標準制訂的目的和意義1、任務來源根據(jù)四川省市場監(jiān)督管理局關(guān)于下達2020年度地方標準制修訂項目立項計劃（第四批）的通知（川市監(jiān)函2020560 號）第46號，由四川省動物疫病預防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學負責制定豬蓋塔病毒分離與鑒定技術(shù)規(guī)范。（聯(lián)系人：陳弟詩；聯(lián)系電話2、背景塞內(nèi)卡病毒A(Senecavirus A，SVA)又稱為塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)，為小RNA病毒科塞尼卡病毒屬的唯一成員，現(xiàn)已證實SVA感染豬能夠引發(fā)原發(fā)性水泡病，引起豬的鼻吻、蹄部冠狀帶的水泡病變，同時伴有跛行、

2、厭食、嗜睡和發(fā)燒等臨床表現(xiàn)。與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎引起的臨床癥狀難以區(qū)分。自2015年以來，在美國、中國、泰國等多個國家暴發(fā)了SVA疫情，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。SVA由于近些年才被發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀類似于口蹄疫，使得感染豬只的上市存在重大的風險。對于SVA這樣的豬場新病，全世界對其認知都比較有限，其對于豬場的短期和長期影響難以確切估計。SVA在巴西、美國和我國幾乎同時發(fā)生，說明其從被發(fā)現(xiàn)至今，或有進一步擴大和爆發(fā)的可能，而作為新出現(xiàn)的疾病，其潛在影響是不可估量的，不得不引起足夠的重視。且目前該病并無成熟的商業(yè)疫苗及相關(guān)檢測標準。因此，急需提出和制定針對該病原準確、有效、可行的分離鑒定標準

3、，這對我省乃至我國尤其是在非洲豬瘟常態(tài)化形勢下，豬A型塞內(nèi)卡病毒的檢測、監(jiān)測、流調(diào)、預警、風險評估、防控到凈化有十分重要的意義。針對該病的不斷擴散，急需提出和制定有效且準確的診斷標準。3、 任務性質(zhì)：豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定標準地方標準制訂工作。4、 起草單位：四川省動物疫病預防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學。5、主要起草人及其工作：姓 名單位名稱職稱/職務項目分工聯(lián)系電話陳弟詩四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師主持，負責項目設計與實施，協(xié)調(diào)項目小組、標準內(nèi)容的擬定、撰寫、審核志文四川農(nóng)業(yè)大學二級教授主持，負責項目設計與實施、協(xié)調(diào)技術(shù)專家、技術(shù)方法的建立、驗證1398160

4、4765邵靚四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師主持，負責項目設計與實施，技術(shù)方法審核、復 斌四川省動物疫病預防控制中心推廣研究員負責協(xié)調(diào)項目小組，方案、技術(shù)方法審定、審玲四川農(nóng)業(yè)大學教授收集技術(shù)資料、技術(shù)方法的建立、驗證、復核毅四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師調(diào)研、收集技術(shù)資料、技術(shù)方法試驗、驗證、復核、審超信四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師調(diào)研、收集技術(shù)資料、技術(shù)方法復核、審冬四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師收集技術(shù)資料、技術(shù)方法驗證、復核、修訂13

5、551008291邱明雙四川省動物疫病預防控制中心獸醫(yī)師收集技術(shù)資料、技術(shù)方法驗證復核、修璐琪四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師調(diào)研、收集技術(shù)資料、技術(shù)方法復淳四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師收集技術(shù)資料、意見征詢和修代芬四川省動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師技術(shù)方案審核、意見征詢和修周四川省動物疫病預防控制中心獸醫(yī)師收集技術(shù)資料、意見征詢和修偉樂山市動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推凌遂寧市動物疫病預防控制中心高級

6、獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推波綿陽市動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推燁巴中市動物疫病預防控制中心獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推崗自貢市動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推秋霞雅安市動物疫病預防控制中心高級獸醫(yī)師技術(shù)方法驗證、技術(shù)應用推賢剛四川農(nóng)業(yè)大學辦公室主任調(diào)研、協(xié)調(diào)項目小組、意見征詢彭珂楠四川農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)碩士撰寫、技術(shù)方法的建立、試驗、驗證令華四川農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)碩士撰寫、技術(shù)方法的建立、試驗、驗證

7、二、主要工作過程1、前期工作計劃任務下達前，標準起草單位的科技人員對豬A型塞內(nèi)卡病毒開展綜合性調(diào)研，查閱、收集相關(guān)的文獻、技術(shù)資料，并建立分離鑒定方法并進行重復試驗，提出標準制定方案。2、成立標準制訂項目小組2020年1月計劃任務下達后，由四川省動物疫病預防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學的專家、技術(shù)人員組成標準制訂項目小組，對標準制訂工作進行分工，明確任務和職責，以確保項目的順利實施。3、資料收集和技術(shù)驗證2020年2月至2020年9月，項目小組查閱國內(nèi)有關(guān)豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)范的資料，擬定標準內(nèi)容、對標準中提出的技術(shù)方法方案進行討論復核、對標準中建立的分離鑒定方法

8、進行充分驗證核實。4、形成初稿2020年9月至10月，根據(jù)收集的相關(guān)技術(shù)資料、文獻以及技術(shù)方法方案的驗證核實，形成標準初稿；在初稿制定過程中，標準制訂項目小組多次進行內(nèi)部討論，不斷征求有關(guān)專家的意見，修改完善。5、完善草稿，形成送審稿標準初稿形成后，標準制訂項目小組準備2020年11月至12月征求高等院校、科研院所、各市（州）農(nóng)業(yè)農(nóng)村和疫控中心的獸醫(yī)專家、技術(shù)人員的意見，使之更符合規(guī)范，更切合實際，具實用性、操作性和指導性，并將收集的意見進行匯總處理，修改完善后形成豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定標準送審稿。三、標準編制原則和主要內(nèi)容確定依據(jù)1、編制原則遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，注

9、重標準的通用性、適用性和可操作性，同時符合我國國情。（1）以符合國家及地方相關(guān)法律、法規(guī)的規(guī)定為原則；（2）以符合已頒布的國家及行業(yè)等相關(guān)標準為原則；（3）本標準立足于豬A型塞內(nèi)卡病毒最新研究成果，參考國內(nèi)外豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定資料，增強標準的科學性和先進性，其頒布、實施、應用有利于豬A型塞內(nèi)卡病毒檢測診斷、監(jiān)測流調(diào)、預警預報和預防控制等，保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。（4）本標準通俗易懂，具有較強的可操作性和實用性。2、標準主要參數(shù)和檢驗規(guī)則等確定的依據(jù)本標準技術(shù)內(nèi)容的依據(jù)如下：GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB 19489 實驗室生物安全通用要求NY/T 541-

10、2016 獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣品運輸包裝規(guī)范（農(nóng)業(yè)部公告第503號）國家民航局關(guān)于運輸動物菌毒種樣本病料等有關(guān)事宜的通知（局發(fā)明電20084487號）3、主要內(nèi)容及特點按照國家和行業(yè)標準格式和GB/T1.1-2009標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則要求，本標準主要規(guī)定豬A型塞內(nèi)卡病毒的分離材料、樣本的采集、保存、運輸和處理、細胞分離培養(yǎng)病毒、RT-LAMP核酸檢測方法、判定標準等內(nèi)容，其目的是規(guī)范豬A型塞內(nèi)卡病毒的分離鑒定技術(shù)，達到標準化程度。特點：豬A型塞內(nèi)卡病毒的分離與鑒定是該病毒診斷的確認性方法，也是塞內(nèi)卡病毒病檢疫、診斷和流行病學調(diào)查的重要方法

11、之一，其主要目的是：對疑似塞內(nèi)卡病毒病豬進行確診；對豬進行檢疫，確定是否帶有SVA；對發(fā)生的塞內(nèi)卡病毒病疫情進行流行病學調(diào)查、追蹤調(diào)查或回顧性調(diào)查；對新分離的SVA流行毒株進行基因分型鑒定和分子流行病學分析等進一步研究。該方法較免疫標記技術(shù)更加敏感。由于SVA在細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生致細胞病變效應（CPE），因此病毒的分離鑒定可以通過在敏感細胞上培養(yǎng)并增殖，通過觀察病毒在敏感細胞上產(chǎn)生的細胞病變效應（CPE），然后對在細胞培養(yǎng)中增殖的病毒采用RT-LAMP方法或RT-PCR擴增和序列測定來確認。該方法主要根據(jù)本實驗室的成熟的操作程序，并參照參考OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊（2017年版）而形成

12、。方法詳實，具有可操作性。4、 制定本標準的基礎四川省動物疫病預防控制中心是四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳直屬事業(yè)單位，主要負責全省動物疫病的預防、控制、撲滅工作。中心建有生物安全二級和生物安全三級實驗室，具備國家檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認定資質(zhì)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)實驗室考核合格。曾于2012年分離出四川省第一株蚊源蓋塔病毒，鑒于中心職能職責，其能及時監(jiān)測蓋塔病毒流行情況并提供預測信息。中心近年國內(nèi)外發(fā)表論文200余篇，編寫四川省地方標準40余部。累計取得的部省級獎勵12項，其中二等獎5項，三等獎7項?，F(xiàn)有推廣研究員7人，高級獸醫(yī)師14人，獸醫(yī)師14人；其中，博士8人、碩士18人，3人被評為四川省有突出貢獻中青年專家，

13、已具備強大的人才陣容及完善的設施設備為該項目提供了強大的技術(shù)及硬件支撐。合作研究單位四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心長期從事動物傳染性疾病研究，在動物傳染病研究中積累了豐富的經(jīng)驗，近年來共承擔了國家973、863、國家科技支撐計劃、國家自然科學基金等多個科研項目。在動物重大傳染病的病原學、流行病學、偽狂犬病毒基因載體疫苗和配套分子診斷試劑的研究中取得了重大科技成果并形成了顯著的特色和優(yōu)勢。獲國家二類新獸藥證書1個，國家發(fā)明專利1項，申報國家發(fā)明專利10余項，發(fā)表論文200余篇。以上研究成果為本項目的實施提供了強有力的技術(shù)支撐。四、主要試驗或驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效果（一）主

14、要試驗或驗證的分析本標準豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定標準為新制定地方標準，對本標準中“豬A型塞內(nèi)卡病毒細胞病變（CPE）觀察結(jié)果”和 “豬A型塞內(nèi)卡病毒RT-LAMP檢測方法”的主要試驗或驗證的分析如下：1 細胞病變（CPE）觀察結(jié)果SVA感染PK-15細胞后約36 h，出現(xiàn)典型的細胞病變效應（CPE），其特征為圓形，收縮和碎裂（如圖1）。圖1 SVV-SC-01株感染PK-15細胞36h后產(chǎn)生的細胞病變注：A 未感染PK-15細胞對照；B SVV-SC-01株感染PK-15細胞36h后產(chǎn)生的細胞病變；2 RT-LAMP檢測結(jié)果2.1 引物的設計根據(jù)GenBank上已發(fā)表的SVA核酸序列(登錄號:

15、 KY618836)，選擇編碼VP1蛋白的序列作為RT-LAMP的靶序列，運用Primer Explorer V4 軟件設計一組引物，包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP，引物序列見表 1。表1 引物序列Table 1 Sequences of primers檢測方法引物序列位置(53)RT-LAMPSVV F3CCGATCTCGACTACTGAATG28662886SVV B3GAGAACGCCACTGTCAGAC30173036SVV FIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC28812941SVV BIPTTCTAACACCCCGCCCAA

16、CA-TTGACGTACAGGCCGAAAC295330132.2 質(zhì)控樣本的制備和信息陽性對照：四川豬源SVV-SC-01株病毒液。陰性對照：無菌PBS緩沖液。2.3 特異性試驗應用建立的RT-LAMP檢測方法對SVA、FMDV、PRV 、PRRSV和CSFV進行檢測，結(jié)果顯示只有 SVA 陽性模板經(jīng) RT-LAMP擴增可見梯形條帶。相反，其他病毒未出現(xiàn)條帶，表明該RT-LAMP 檢測方法具有較高的特異性，見圖2。圖2不同病原檢測結(jié)果Figure 2 Detection of different pathogensM: DNA 分子質(zhì)量標準；16: 分別為 SVA 、FMDV、PRV 、PR

17、RSV 、CSFV、陰性對照。2.4 敏感性試驗圖 3表明，RT-LAMP 在稀釋度為1×101拷貝時仍可以檢測到，而傳統(tǒng)RT-PCR只能檢測1×104拷貝數(shù)的核酸量。反應混合物中加入 SYBR Green I，熒光強度隨病毒數(shù)量降低而降低，顯色情況如圖 3A。圖3 RT-LAMP敏感性試驗Figure 3 Sensitivity tests using the RT-LAMPA：LAMP-SYBR Green 顯色；B：LAMP 電泳結(jié)果；C：RT-PCR電泳結(jié)果。M：DNA 分子質(zhì)量標準；18：1×107拷貝1×100拷貝；9：陰性對照經(jīng)上述研究表明

18、，該分離鑒定診斷方法具有以下優(yōu)點：1)獲得活病毒：此方法是獲得活病毒十分重要的金標準方法；2)準確性高：對病毒含量較少的樣品，需通過病毒的分離增殖來提高診斷的準確性和鑒定的可靠性；3)靈敏性高：該RT-LAMP方法可檢測到低至1×101拷貝數(shù)的樣本，對SVA疫情進行流行病學調(diào)查、追蹤調(diào)查或回顧性調(diào)查提供可靠檢測方法。（二）預期的經(jīng)濟效果四川地區(qū)的生豬飼養(yǎng)量居全國前列。豬A型塞內(nèi)卡病毒近年在四川地區(qū)開始流行，嚴重危害我省乃至我國的養(yǎng)豬業(yè)。因此，豬A型塞內(nèi)卡病毒的監(jiān)測和診斷是防控豬A型塞內(nèi)卡病毒的重要措施。本制訂標準中對豬A型塞內(nèi)卡病毒的分離和RT-LAMP檢測方法均進行了詳細闡述，全面規(guī)范和標準化豬A型塞內(nèi)卡病毒的分離鑒定技術(shù)，不但對豬A型塞內(nèi)卡病毒的防控工作將起到重要的作用，還將產(chǎn)生極大的直接及間接經(jīng)濟效益。五、采用國際標準和國外先進標準的程度無六、與現(xiàn)行的法律、法規(guī)和強制性國家標準的關(guān)系本標準制定遵循GB/T1.1-2009、中華人民共和國動物防疫法、GB/T18088-2000、國家動物疫情測報體系管理規(guī)范、病原微生物實驗室生物安全管理條例、動物檢疫管理辦法、農(nóng)業(yè)部國家（行業(yè)）標準的計劃編制、制定和審查管理辦法等相關(guān)法律、法規(guī)規(guī)定。七