液相色譜使用及維護相關(guān)知識

1、.液相色譜使用及維護相關(guān)知識HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成.有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、柱溫控制器等。一、 輸液泵1. 泵的構(gòu)造及原理目前高效液相輸液泵多用柱塞往復(fù)泵，一般都采用雙泵補償法。如圖所示：泵1的缸體容量是泵2的兩倍，兩者的柱塞運動方向相反。泵1吸液時，泵2排液；泵1排液時，泵2吸取泵1輸出量的1/2，這樣往復(fù)運動，保證輸液的連續(xù)性。2. 泵的使用及維護注意事項 泵使用時要注意：a.防止固體微粒進入泵體，泵的入口都連接有砂濾片（或棒），濾器要經(jīng)常清洗或更換。b.流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是

2、在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，會增加泵頭內(nèi)的寶石活塞桿和活塞的磨損。c.泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。d.流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。泵的一般故障排除：a.沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如3ml/min）下運轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。 

3、60;  b.壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。二進樣器 HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。1隔膜進樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸

4、附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達到12%。 2停流進樣?？杀苊庠诟邏合逻M樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)"鬼峰"；另一缺點是保留時間不準。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。3閥進樣。一般HPLC分析常用六通進樣閥 。 六通閥的進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。用部分裝液法進樣時，進樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（最多75），并要求每次進樣體積準確、相同。用完全裝液法進樣時，進樣量一般定量環(huán)體積的35倍，這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進樣的準確度及重復(fù)性。 六通閥使用和維護：樣品溶液進樣前

5、必須用0.45m濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。三.色譜柱柱的使用和維護:    避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行。    應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特

6、別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑直接改變?yōu)樗唷?#160;   一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。    選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱與預(yù)柱填料相似。    經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積至少應(yīng)是柱體積的5倍以上。四.檢測器 UV檢測器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器，主要性能指標

7、: 1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時，基線帶寬為噪音，基線在1小時內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速（泵的脈動）和溶劑（純度、含有氣泡、固定相流失）的影響。2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時所給出的信號大小。3）檢測限.檢測器靈敏度的高低，并不等于它檢測最小樣品量或最低樣品濃度能力的高低，因為在定義靈敏度時，沒有考慮噪聲的大小，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。檢測限是檢測器的一個主要性能指標，其數(shù)值越小，檢測器性能越好。檢測器的故障及排除1）流動池內(nèi)有

8、氣泡    如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰"，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣。2）流動池被污染    無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進行清洗。檢測器對溫度有一定的敏感度。紫外檢測器一般在溫度波動超過±0.5時，就會造成基線漂移起伏。流動相：理想的液相色譜流動相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。反相色譜的流動相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求，且流動相粘度小、價格低，是反相色譜最常用的流動