大專生物化學(xué)專題一膠原蛋白的提取資料

1、生物化學(xué)實用技術(shù)章宇寧 2012.3膠原蛋白是一種極其重要的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中。 占哺乳動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%30%，相當(dāng)于體重的6%至少有19種不同的類型 一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)通常由3 條多肽鏈組成，每條鏈都有左手螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈繞成右手超螺旋。螺旋區(qū)段之外的部分常發(fā)生各種交聯(lián)。每一條鏈都有若干個典型的氨基酸序列(-Gly-X-Y-) n 。X、Y 均表示任意的氨基酸,X 通常是脯氨酸(Pro) , Y 通常指羥脯氨酸(Hyp )膠原蛋白中缺少Cys和Try 制造食品止血，促進(jìn)傷口愈合作為可吸收的支架材料、縫合材料作為藥物載體

2、局部整形從膠原蛋白較為豐富的組織（例如皮膚和肌腱）中提取傳統(tǒng)來源：豬牛羊皮新興來源：魚鱗等問題一：如何從原料中提取蛋白？問題二：如何從蛋白中分離膠原蛋白？問題三：如何檢驗得到的蛋白是膠原蛋白？前處理粗分級（粗提）細(xì)分級（分離純化）作業(yè)一：某一特定蛋白質(zhì)分離提純的一般程序是什么？破碎組織細(xì)胞，使蛋白更好地與外界條件接觸盡量保持蛋白的天然構(gòu)象和生物活性注意控制條件必要時加入蛋白保護(hù)劑可以先將某一細(xì)胞組分分離出來動物材料動物材料：除脂肪組織：除脂肪組織- - 電動搗碎機(jī)、勻漿器、電動搗碎機(jī)、勻漿器、 超聲波超聲波植物組織植物組織：去種皮：去種皮- - 石英砂、玻璃粉石英砂、玻璃粉細(xì)菌細(xì)胞細(xì)菌細(xì)胞：超

3、聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶：超聲波震蕩、砂研磨、高壓、溶菌酶稱取新鮮豬皮100g，用氯仿/乙醇（2:1）溶液對其進(jìn)行脫脂后切除皮下脂肪，去毛并細(xì)切。將用蒸餾水洗滌后的組織小塊放入高速組織搗碎機(jī)中搗碎成糊狀（12000r/min），用含4.5mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）充分洗滌以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4OC）。第一步：將蛋白與材料分開，使其進(jìn)入溶液中酸溶堿溶鹽溶酶解注意根據(jù)所要提取的蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇合適的粗分級方法提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。

4、前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。稀酸，例如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在23之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結(jié)合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質(zhì)量，取決于處理時間以及堿的濃度。酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水提取膠原蛋白常使用的溶劑是中性鹽溶液(0.152mol/L NaCl)或是稀醋酸溶液。前者只適合提取組織中最新合成的膠原以及交聯(lián)度可以忽略的膠原。稀酸，例

5、如0.5mol/L醋酸，檸檬酸緩沖液，pH值在23之間的鹽酸溶液，要比中性鹽溶劑更為有效，但仍只能溶解出組織中大約2%的膠原。利用10%的NaOH溶液共同處理組織48h左右，可以溶解出大部分膠原。與不溶性膠原結(jié)合在一起的脂肪被皂化，非螺旋的端肽被切除，膠原纖維瓦解。最終所得膠原的大小和分子質(zhì)量，取決于處理時間以及堿的濃度。酶可以將膠原蛋白分子的端肽切除或部分水解，使之易溶于水第二步：用簡便且處理量大的方法去除無機(jī)物等雜質(zhì)，得到濃縮蛋白質(zhì)溶液鹽析等電點(diǎn)沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法超濾如蛋白相互差異較大，也可初步分離目標(biāo)蛋白 可逆沉淀鹽析法鹽析法( (中性鹽沉淀法中性鹽沉淀法) )：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量

6、的中性鹽,使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。常用中性鹽有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：常用與水互溶的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等，破壞水膜，使其沉淀。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)所帶蛋白質(zhì)所帶凈電荷凈電荷為零為零時，所處溶液的時，所處溶液的pHpH 值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)最不穩(wěn)定，溶解度最小。利用具有一定大小利用具有一定大小孔徑的孔徑的微孔濾膜微孔濾膜，對生物大分子溶液對生物大分子溶液進(jìn)行過濾，使大分進(jìn)行過濾，使大分子保留在超濾膜上子保留在超濾膜上面的溶液中，小分面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出子物

7、質(zhì)及水過濾出去，從而達(dá)到脫鹽去，從而達(dá)到脫鹽或濃縮的目的?；驖饪s的目的。進(jìn)一步分離純化目標(biāo)蛋白質(zhì)透析超濾凝膠過濾/層析/離子交換色譜密度梯度離心電泳等電聚焦在粗提膠原蛋白溶液中緩慢加入6mol/L NaOH至pH=7，冷凍離心去除沉淀，在上清液中加入NaCl攪拌，4保存過夜；離心取沉淀，用稀HAc溶解，將溶液裝入透析袋中，用0.1mol/L 的Hac透析1天，再用蒸餾水透析1天。電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電電泳：帶電顆粒在電場中向電荷相反的電極移動的現(xiàn)象極移動的現(xiàn)象不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶的不同的蛋白質(zhì)顆粒的大小、形狀、所帶的電荷、等不同，在電場中的泳動速度各異，電荷、等不同

8、，在電場中的泳動速度各異，因而可聚集形成不同的條帶，從而達(dá)到分因而可聚集形成不同的條帶，從而達(dá)到分離的目的。離的目的。 層析法：層析法：離子交換層析法離子交換層析法凝膠過濾層析法凝膠過濾層析法親和層析法親和層析法吸附層析法吸附層析法分配層析法分配層析法離子交換層析法離子交換層析法原理原理: :根據(jù)根據(jù)離子交換劑離子交換劑與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換，與蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換，再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即可達(dá)到分離再利用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，即可達(dá)到分離具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的目的。具有不同電荷性質(zhì)蛋白質(zhì)的目的。原理：原理： 混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內(nèi)混合物流經(jīng)裝有凝膠顆粒（凝膠顆粒內(nèi)部具有大量一定大小的

9、微孔）的層析柱時，部具有大量一定大小的微孔）的層析柱時，大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移動較快，并最大分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，移動較快，并最先被洗脫出來；小分子能不同程度的自由出先被洗脫出來；小分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長，移入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長，移動速度較慢，最后被洗脫出來。動速度較慢，最后被洗脫出來。親和蛋白親和蛋白配基配基原理：原理：利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專一性利用某種蛋白質(zhì)能與其相應(yīng)的專一性配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合的能力（親合力）配基進(jìn)行特異的可逆結(jié)合的能力（親合力）來純化生物大分子。來純化生物大分子。原理：原理：在密度梯度介質(zhì)（蔗糖或甘油）中在密度梯度介質(zhì)（蔗糖或甘油）中進(jìn)行的一種沉降速度