發(fā)酵大實驗實驗報告

1、2010級發(fā)酵大實驗（1）實驗報告任課老師：姓名：專業(yè)：生物技術班級：學號：日期：2013年6月實驗報告、目的要求：了解篩菌的基本操作，包括：培養(yǎng)基配制，滅菌，接種，涂板，搖菌，紫外 分光光度計的使用等。二、實驗材料1、菌種來源：英語公園葡萄樹下土壤和生物學院院樓門口土樣。o 嚴去甘2、培養(yǎng)基：(1)淀粉液體培養(yǎng)基： 可溶性淀粉 1%、蛋白胨 1% 、葡萄糖 0. 5%、NaCl 0. 5%、 牛肉膏 0. 5%(2)淀粉固體培養(yǎng)基 : 可溶性淀粉 1%、蛋白胨 1% 、葡萄糖 0. 5%、NaCl 0. 5%、 牛肉膏 0. 5%、瓊脂粉 1.5% 。3、器皿：試管，量筒，燒杯，移液管，培養(yǎng)

2、皿，洗耳球，玻璃棒，酒精燈， 接菌環(huán)，三角瓶，玻璃棒等。4、儀器：高壓蒸汽滅菌鍋，水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，搖床，天平、紫外可見分 光光度計等。5、試劑： 1%碘液、 1M NaOH 、 DNS、 pH 5.6 0.05M 乙酸 /乙酸鈉緩沖液、 1%淀粉溶液、 1mg/mL 的麥芽糖，結晶紫溶液。6、其他：封口膜、紗布，棉花，試管架等。三、實驗步驟：1、初篩： (1)配制培養(yǎng)基：按照上述培養(yǎng)基成分及數量稱取各物質，放入三角瓶中，加 水到100ml，包扎。和包扎好的試管、移液管、涂布器、培養(yǎng)皿等一起放入滅菌 鍋中121C高壓滅菌20min。然后干燥后使用。(2)倒平板：把培養(yǎng)基置于無菌工作臺上，待冷

3、卻到 55 C左右后，倒入滅菌后 的平板中，每個平板中約15-20ml，之后待冷卻凝固。( 3)菌懸液制備：我們組分別從英語公園的葡萄樹下和生物學院院樓門口采集土樣，各稱取10g，放入裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩20min后靜置5min。( 4)濃度稀釋：在無菌試驗臺上進行濃度梯度稀釋 ,把土樣搖勻，從中吸取 1ml 置于事先滅好菌的試管中，再加入 9 ml 無菌水，再從該試管中吸取 1ml 土樣置 于另一只無菌試管中，加入9ml無菌水，依次稀釋到10八-5、10八-6、10八-7、10A-8 待用。(5) 涂布平板：在超凈工作臺中，分別在10A-5、 10A-6、 10A-7、 10A

4、-8 濃度下各取 1 ml 兩種土壤稀釋液倒入已冷卻的平板中(因有一根試管破裂所以第二組 土壤缺少 10A-7 濃度的稀釋液，不過不影響之后的實驗) 。用涂布器涂布均勻， 在平板上標注土樣的濃度。把標注好的培養(yǎng)皿放入37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h 。(6) 加碘篩選：取出培養(yǎng)好的平皿，放入冰箱中培養(yǎng) 24h,取出后在長出的菌 落上滴加碘液，菌落周圍如有無色透明圈出現， 說明淀粉被水解，即該菌株能 產生淀粉酶。2、復篩：平板劃線：用上述配制培養(yǎng)基和到平板的方法再制得培養(yǎng)基， 用滅過菌的接 菌環(huán)從上述培養(yǎng)皿中挑去菌落周圍透明圈和菌落直徑比值較大的菌落在新配置 的培養(yǎng)基上進行劃線分離，

5、之后進行濃度標注。將標注好的培養(yǎng)皿放入 37 C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16-18h。3、檢測菌種淀粉酶酶活：(1)配培養(yǎng)基：配置上述液體培養(yǎng)基，分裝到多個100ml錐形瓶中，滅菌。( 2)接種：再次滴加碘液，挑選得到的周圍透明圈較大的菌落，刮取1 環(huán)接種至滅菌的含 30/25mL 液體培養(yǎng)基的三角瓶中。并做好標記，方便后續(xù)菌種的保 存接種后的培養(yǎng)基至于搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為： 30C， 180r/min、 6 小時后即 可。( 3)測麥芽糖標準曲線：1) 濃度為 1mg/mL 的麥芽糖標準液的配制：準確稱取50mg麥芽糖于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入 50mL容 量瓶中用蒸餾水定容至5

6、0mL，充分混勻。待用。2) 取8支洗凈烘干的10mL具塞刻度試管，編號后按表2加入標準麥芽糖(G) 溶液和蒸餾水， 配制成一系列不同濃度的麥芽糖溶液。 充分搖勻后， 向各試管中 加入2.0 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10mL， 充分混勻。在 540nm 波長下，以 1 號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以麥芽糖含量（mg）為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，繪制出麥芽糖標準曲線。表1麥芽糖標準曲線制作管試劑號12345678麥牙糖標液(mL00.20.40.60.81.01.21.4蒸餾水（mL2.01.81.61.4

7、1.21.00.80.6麥牙糖含量(mg00.20.40.60.81.01.21.4OD4o（4）測菌液濃度（比濁法）：以參比液為空白對照，測定待測液 OD590nm處的吸光值，以0D值標示枯草芽 抱桿菌的生物量。0D值最好等于1.（5） 稀釋菌液：通常用去滅菌去離子水稀釋稀釋到50-200倍，但因為我們組的 菌液測濃度較低，故并沒有進行稀釋直接用的原液。（6）、淀粉酶活力的測定：1）取10mL刻度試管2支（標記為A、B ），分別加入0.5mL已稀釋的待測酶液。2）在B管中加入0.5mL 1M NaOH滅酶活，A管中加入0.5 mL pH 5.6 0.05M乙酸/乙酸鈉緩沖液。然后在兩管同時加

8、入 0.5 mL 1%淀粉溶液作為反應底物。3）40 T恒溫水浴鍋準確反應5 min4）A管加入0.5 mL 1M NaOH滅酶活，B管中加0.5 mL pH 5.6 0.05M乙酸/乙酸 鈉緩沖液。兩管加顯色劑 DNS試劑2.0 mL，沸水反應5 min，反應后迅速冷卻 定容至10mL o5）用分光光度計再540nm處比色，用B管作為對照，測定OD540nm值。6）根據麥芽糖標準曲線計算麥芽糖含量（G）和發(fā)酵液中酶活力。酶活力定義：40°C，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成 1 mg麥芽糖所需要的 酶量為一個活力單位（U）計算公式：酶活力=y/生物量OD值/5X 20X菌液稀釋倍數可得

9、（7）結果分析：若發(fā)酵液酶活性v 0.1U，基本可視為雜菌污染四、實驗結果:1、初篩結果：圖1梯度10-5的土壤菌種初篩結果 圖2.梯度10-6的土壤菌種初篩結果圖3.梯度10-7的土壤菌種初篩結果圖3梯度10-8的土壤菌種初篩結果2、初篩加碘液結果：圖1梯度10-8的土壤菌種結果圖2.梯度10-8的土壤菌種結果注：因為其他梯度出現的透明圈幾乎可以忽略，只有10-8出現了很明顯很大的透明圈，故我們組主要進行這個梯度的后續(xù)實驗， 故其他梯度的結果忽略不計，故 未照相。3、復篩結果:圖1梯度10-8的土壤菌種復篩結果經過平板劃線，只有梯度為10-8只有的菌種分離了，其他梯度的菌種仍是以 線性存在，

10、可惜的是我們組當時沒有想到要照相，只留了 10-8這個梯度的結果， 加完碘液后仍然具有很大的透明圈，這個菌很有可能就是我們的目的菌。4、麥芽糖標準曲線：表2麥芽糖標準曲線管試劑號12345678麥芽糖標液(mL00.20.40.60.81.01.21.4蒸餾水（mL2.01.81.61.41.21.00.80.6麥芽糖含里(mg00.20.40.60.81.01.21.4OD4o00.2100.5110.9991.3811.8152.0262.249可得標準曲線為：y=0.0564x+0.0048,其中y為麥芽糖含量，x為0D值5、菌濃度的測定：表3菌濃度測定編號菌種梯度OD值10.0000.

11、000210-70.056310-8（ 1）0.191410-8（ 2）1.577&酶活測定實驗:表4酶活測定實驗編號菌種梯度OD值110-70.022210-8（ 1）0.011310-8（2）0.0947、計算麥芽糖含量根據麥芽糖標準曲線，計算所得麥芽糖含量表5麥芽糖含量編號梯度0D值x麥芽糖含量y110A-70.0220.0060210A-8 (1)0.0110.0054310A-8 ( 2)0.0940.01018、計算酶活表 6 酶活計算編號梯度麥芽糖含量 y酶活 (U/mL)110A-70.00600.4286210A-8(1)0.00540.1131310A-8(2)0.

12、01010.0256五、結果分析：本實驗的設計方案具有一定的理論依據， 如果操作得當， 各方面條件滿足， 會 得到產淀粉酶的活性芽孢桿菌高產菌株， 及該菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。 但操作 過程存在很多缺陷，導致結果失敗，主要問題有：1、分離芽孢桿菌時，稀釋度不夠導致水解圈粘連；2、DNS 法測 OD 值時，一部分數據顯著偏大，可能是稀釋倍數不夠所致；3、DNS 法測 OD 值時，由于操作失誤，忘記每個試管做平行測量，造成結果不 精確；4、取樣過于隨意，所取土壤中含酶活的細菌不多；5、無菌操作不是很標準，可能造成染菌。6、富集培養(yǎng)時未除去土壤。效果同加入過多的葡萄糖一樣，土壤中有一部分營 養(yǎng)物質，

13、 致使長過多的雜菌， 實驗時應該出去土壤， 但是當時又怕細菌都吸附在 土壤顆粒上，除去土壤的同時會除去細菌。應該注意大膽嘗試，做一組試試看， 說不定結果會很好。7、培養(yǎng)基中加入葡萄量可能頗多，導致細菌利用較多利用葡萄糖，產生的淀粉 水解圈不明顯。 培養(yǎng)基中加入葡萄糖， 原因是芽孢萌發(fā)時加葡萄糖以利生長， 但 是可能是當時加入葡萄糖的量偏多， 使不能利用淀粉的細菌芽孢也萌發(fā)， 致使有 較多雜菌不利于檢驗， 同時又使可利用淀粉的細菌芽胞萌發(fā)成營養(yǎng)細胞后利用葡 萄糖，而不是利用淀粉， 致使產生的淀粉水解圈太小。 下次實驗時應注意仔細查 閱資料及詢問老師，控制好加入的營養(yǎng)物質的量。六、個人心得：在自然

14、界的土壤中存在能產生淀粉酶的芽孢桿菌， 通過土樣稀釋、 加熱土樣 懸液、殺死非芽孢細菌、 平板分離可獲得疑似芽胞桿菌的單菌落， 將單菌落點接 含有淀粉的平板， 具有產淀粉酶能力的芽孢桿菌， 水解淀粉生成小分子糊精和葡 萄糖，在淀粉平板上菌落周圍也會出現水解圈， 但肉眼不易分辨， 用碘液染色法 染色后顯現出透明圈， 未水解的淀粉呈藍色， 水解圈無色。 由此可將產淀粉酶能 力的菌株分離。透明圈與菌落直徑比值的大小在一定程度上反映了菌落純度和產 淀粉酶的活力菌株產生淀粉酶的能力： 前者與后者的比值越大， 表明分泌的淀粉 酶越多，水解淀粉的能力也就越強。土壤中存在產淀粉酶的細菌， 然而，土壤中存在的產淀粉酶的細菌在整個土 壤細菌中所占的比例是較小的， 土壤中絕大多數的細菌是不能產生淀粉酶的。 高 溫對于土壤中的不耐熱的細菌具好的消滅效果，卻對產淀粉酶的細菌沒有影響。 所以，可以通過高溫處理來提高分離出來的產淀粉酶細菌的純度。 由于受實驗設 備及實驗操作等方面的影響，經初步篩選出的含淀粉酶細菌中仍混有其它雜菌。 所以，我們應該對初步篩選出的細菌再次進行篩選， 篩選出純度較高的含淀粉內 細菌，并用顯微鏡觀察其菌落的特征， 對照辨別其所屬菌種。 針對該菌種的特性， 對其淀粉酶的活性、生長周