茶多酚誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞株凋亡及上調(diào)PTEN表達(dá)

1、茶多酚誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞株凋亡及上調(diào)PTEN表達(dá)【摘要】 目的 探討茶多酚抑制膀胱癌細(xì)胞生長的可能分子機(jī)制。 方法 采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)，觀察膀胱癌細(xì)胞系T24 經(jīng)不同濃度的茶多酚處理后對細(xì)胞生長以及PTEN蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果 茶多酚以劑量依賴的方式抑制膀胱癌細(xì)胞的生長，加入0、50、100、200、400g/ml茶多酚的T24 細(xì)胞抑制率分別為0%、11.2%、33.4%、36.9%、67.5%。流式細(xì)胞儀直方圖上可見亞二倍體峰，癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，凋亡率分別為6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%;同時，隨茶多酚作用濃度的增加，出現(xiàn)G1/S阻滯細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞分裂

2、增殖指數(shù)(PI) 降低;而細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)水平由(37.66±0.49)逐漸增加至(163.92±3.36)(P< 0.01)。 結(jié)論 茶多酚對T24細(xì)胞生長具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)PTEN 蛋白表達(dá)影響細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PTEN蛋白表達(dá)水平的上調(diào)可能具有逆轉(zhuǎn)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為作用。 【關(guān)鍵詞】 茶多酚 膀胱癌 凋亡 PTEN 蛋白【Abstract】 Objective To explore the molecular mechanism of inhibition effect of tea polyphenols on the gr

3、owth of bladder carcinoma cell lines. Methods MTT assay and flow cytometry(FCM) analysis were applied to investigate the effects of TP on the cellular growth, proliferation cycle, apoptosis, and the expression of PTEN in bladder carcinoma cell lines. Results To inhibited the growth and inducted apop

4、tosis of T24 cells in a dose-dependent manner, under the dosages of 02 / 12g·ml、50g·ml、100g·ml、200g·ml and 400g·ml average inhibitory rate were 0%、11.2%、33.4%、36.9% and 67.5%, and hypodiploid peaks on FCM histogram. Apoptosis rate were 6.8%、25.1%、28.6%、36.6%、41.1%;Moreover,

5、the cell cycle could be arrested at G1/S checkpoint, also made G1 phase cell markedly increasing and the cell proliferating index (Pl) also decreased. At the same time, the expression of PTEN increased from 37.66 ±0.49 to 163.92 ±3.36(P<0.01) with TP treatment. Conclusion TP has the

6、 inhibitory effects on the cellular growth, and the mechanism may be associated with influence in the cell cycle and induction of apoptosis in T24 cell lines. The cell cycle and apoptosis are associated with TP-induced increase of PTEN protein level in the tumor cell lines. At the same time, the up-

7、regulation of the PTEN 's expression by TP also has a possible reversing effects on malignant tumor cells .【Key Words】 Tea polyphenols Carcinoma of bladder Apoptosis PTEN茶多酚(TP) 是茶葉中最具有抗腫瘤活性的酚類及其衍生物為主的酚類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，茶及茶多酚能抑制膀胱癌發(fā)生和進(jìn)展，。作者于2005年9月至2006年5月用TP作用體外培養(yǎng)的膀胱癌T24細(xì)胞株，觀察TP對膀胱癌T24細(xì)胞株生長及其PTEN蛋白表達(dá)水平

8、的影響，探討TP抑制腫瘤細(xì)胞株生長的可能分子機(jī)制。1 材料與方法1.1 膀胱癌細(xì)胞株T24的培養(yǎng) 膀胱移行上皮癌細(xì)胞T24株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生化研究所，于含10%小牛血清的RPMI1640 (Sigma, USA)培養(yǎng)液中37、5%CO2培養(yǎng)。1.2 MTT法觀察 用含10 %小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，分別將2 種對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞調(diào)配成5×104/ ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板(0.2ml/孔) 。設(shè)空白陰性對照及不同濃度(50、100、200、400gml) 的TP組(中國茶葉研究所)，各設(shè)5個平行孔，培養(yǎng)48h，實驗終止前4h加入MTT(Sigma,USA

9、) 液(5mg/ml) 10l/孔，反應(yīng)完畢棄上清液加入DMSO 100l/孔溶解沉淀，輕輕振動后用波長570 nm 的酶聯(lián)儀測定各孔的OD值，求出生長抑制率IR=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。上述所有實驗均重復(fù)3次。1.3 流式細(xì)胞儀測定(FCM) 取對數(shù)生長期的膀胱癌細(xì)胞，取1×106/ml細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板(0.2ml/孔) ，每組3孔。加入不同濃度的TP，并各設(shè)2個平行組為TP組；另外，加入等體積生理鹽水的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液設(shè)為對照組。培養(yǎng)48h后，以0.25%胰蛋白酶(Sigma,USA)消化，制成細(xì)胞懸液，TP組和對照組分別進(jìn)

10、行下列檢測：(1) PBS洗滌2次，加入10mg/L RNaseA 200l，水浴30min，碘化丙啶染色30min，4避光。FCM(BD,USA)檢測細(xì)胞周期，并計算細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(PI)=(S+G2M)/(G1+S+G2M)×100%。(2)平行組和對照組分別加入鼠抗人PTEN(MBI,USA) 20l，PBS 洗滌5min×3次。加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Zymed,USA) ，37孵育30min，PBS沖洗5 min×3次。對照組1：40稀釋的羊抗鼠IgG-FITC抗體20l。4孵育30 min后，F(xiàn)CM檢測膀胱癌細(xì)胞PTEN的表達(dá)，并以熒光強(qiáng)度的

11、幾何均數(shù)表示。(3) 平等組和對照組分別Celleguest 軟件分析FLA直方圖獲取的陽性標(biāo)記細(xì)胞的凋亡率(APO)。上述所有實驗均重復(fù)3次。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，運(yùn)用SPSS 10.0軟件中的組間采用t檢驗。2 結(jié)果2.1 TP 抑制膀胱癌細(xì)胞生長和細(xì)胞增殖周期的影響在不同濃度TP處理48h后，T24細(xì)胞的生長抑制率隨著TP濃度從0g/ml升到400g/ml，其抑制率為從0增加至11.2%、33.4%、36.9%、67.5%，TP的濃度與其抑制率顯示明顯的正相量效關(guān)系。同時，F(xiàn)CM分析發(fā)現(xiàn)：G1期細(xì)胞所占細(xì)胞周期的百分比隨著TP濃度的增加

12、而增加，S期和G2M 期細(xì)胞逐漸減少，同時隨著TP濃度的增加，PI值逐漸減小，提示細(xì)胞分裂增殖活動逐漸減弱，細(xì)胞各周期中的變化也顯示一定的量效關(guān)系 (見表1)。表1 膀胱癌T24細(xì)胞經(jīng)TP處理前后細(xì)胞各濃度點的分布和PTEN表達(dá)（略）注:TP 作用組與對照組比較:P<0.01,*P<0.052.2 TP 誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡 PI染色FCM檢測可見在正常G1期峰前出現(xiàn)不同于細(xì)胞碎片圖形的亞二倍體峰(凋亡峰) (圖14) ，目前認(rèn)為此峰的出現(xiàn)是確定細(xì)胞發(fā)生凋亡的三個標(biāo)志之一。隨著TP濃度的增加，T24細(xì)胞的凋亡率亦逐漸增加，分別由空白對照組的6.8 %逐漸增加至TP 作

13、用濃度為400g/ml的41.2%，提示TP 誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡率有一定的量效關(guān)系(見圖1,2)。2.3 TP上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá) 由表可見，隨著TP作用濃度的升高，T24細(xì)胞PTEN 蛋白的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，并與TP抑制細(xì)胞的生長(IR值)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡率相平行。在TP>50g/ml的各個濃度點，各細(xì)胞株與其對照組的PTEN蛋白表達(dá)比較，有顯著性差異(P<0.05或P<0.001)。3 討論 茶多酚是非細(xì)胞毒類藥物，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能防止自由基對DNA大分子的損傷和脂質(zhì)過氧化作用，并可通過對基因的調(diào)控或抑制DNA復(fù)制相關(guān)酶的活性和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)而

14、影響DNA合成，也可通過提高機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用抑制癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。 PTEN是一個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN蛋白活性影響細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用及細(xì)胞間粘附功能，它能干擾細(xì)胞信號傳導(dǎo)，使細(xì)胞阻滯于G1期并使其對凋亡敏感，并具有抗腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移作用。Tanaka等將野生型PTEN通過腺病毒載體導(dǎo)入UMUC23和T24膀胱癌細(xì)胞系，使PTEN過表達(dá)，抑制了PKB/ Akt 的磷酸化活性，細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞周期G1期的停滯，生長抑制，形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化，而且對化療藥物的敏感性增強(qiáng)。在乳腺癌細(xì)胞的研究中證實，茶多酚的重要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG

15、)和黃酮類化合物(flavopiridol)分別通過對G1期細(xì)胞的p21、p27、cyclins 和CDKs 的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生生長抑制作用，。本實驗發(fā)現(xiàn)，茶多酚以一定的劑量依賴關(guān)系抑制膀胱癌細(xì)胞生長，上調(diào)膀胱癌細(xì)胞PTEN蛋白的表達(dá)，使膀胱癌細(xì)胞阻滯于G1/S限制點，并誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。推測茶多酚可能通過PTEN表達(dá)的上調(diào)，調(diào)節(jié)cyclinE/D、CDKs、CKIs等活性，通過pRb和/或p53依賴或非依賴等途徑，抑制膀胱癌細(xì)胞生長增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。兩方面的協(xié)同作用可能是TP 殺滅腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制之一。 總之，TP不但能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和上調(diào)PTEN表達(dá)，對其雙重

16、抗腫瘤作用分子機(jī)制的深入研究，有助于TP藥用開發(fā)及利用，為TP應(yīng)用于臨床治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】 1 Lin SS，Hung CF，Tyan YS，et al. Ellagic correction of ellagica acid inhibits arylamine Nacetyltransferase activity and DNA adduct formation in human bladder tumor cell lines (T24 and TSGH 8301). Urol Res,2001,29 (6):371376.2 Sato D. Inhibition of

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