穹窿切斷并摘除腎上腺后大鼠下丘腦CRH表達(dá)變化

1、穹窿切斷并摘除腎上腺后大鼠下丘腦CRH表達(dá)變化 作者：張彥慧,石玉秀,鄭小桃,符皎榮,鐘南田,洪燈【摘要】 目的：觀察下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone, CRH）與糖皮質(zhì)激素的關(guān)系，探討海馬參與HPA軸調(diào)節(jié)的機(jī)制。方法：建立大鼠穹窿切斷模型，采用ELISA方法檢測穹窿切斷0、4、7、10d血中糖皮質(zhì)激素的濃度;建立大鼠穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺7d的模型，采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡方法檢測CRH的表達(dá)變化。結(jié)果：穹窿切斷7d后血中糖皮質(zhì)激素的濃度升高，穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺7d后，下丘腦CRH表達(dá)升高。結(jié)論：海馬通過穹窿對HPA 軸發(fā)揮

2、負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，糖皮質(zhì)激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)下丘腦CRH。 【關(guān)鍵詞】 穹窿切斷術(shù)；穹窿切斷并摘除腎上腺； 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；下丘腦ABSTRACT Objective: To observe the relation between corticotropin releasing hormone （CRH） and glucocorticoid and to explore the mechanism of the hippocampus involved in HPA axis regulation. Methods: The fornix was transected to establ

3、ish a animal model，ELISA was used for detection of glucocorticoid concentrations on day 0，4，7 and 10 after fornix transaction. Immunohistochemical method and Western Blotting were respectively used for the expression of CRH in the hypothalamus after fornix transection and adrenalectomy. Results: Glu

4、cocorticoid concentration was increased on the 7th day after fornix transection. The expression of CRH was up2 / 15regulated on the 7th day after fornix transection and adrenalectomyon. Conclusions: The hippocampus provides a negative feedback to the HPA axis through fornix , the glucocorticoid has

5、a negative feedback effect on CRH. KEY WORDS Fornix transection; Fornix transection and adrenalectomy; Corticotropin releasing hormone; Hypothalamus 應(yīng)激反應(yīng)是以下丘腦 垂體 腎上腺 (hypothalamicpituitaryadrenal, HPA)軸的激活為核心的生理和心理反應(yīng)。應(yīng)激后促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)在HPA軸中發(fā)揮重要作用, 控制著HPA軸的興奮水平1。研究表

6、明海馬對HPA軸有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可能是因?yàn)楹ｑR媒介穹窿對下丘腦室旁核產(chǎn)生了抑制作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠穹窿切斷模型，觀察到穹窿切斷7d后，下丘腦室旁核神經(jīng)元CRH的表達(dá)升高，10d升高顯著2，3。此結(jié)果提示我們，穹窿切斷后海馬對下丘腦室旁核的抑制作用減弱, 室旁核合成CRH增多, HPA軸活動增強(qiáng)。但是血中糖皮質(zhì)激素的濃度升高是否是HPA軸活動增強(qiáng)的結(jié)果，這一點(diǎn)還未曾證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠穹窿切斷模型，檢測糖皮質(zhì)激素濃度變化情況，以進(jìn)一步驗(yàn)證海馬是否媒介穹窿對下丘腦室旁核產(chǎn)生了抑制作用。此外通過實(shí)施穹窿切斷術(shù)同時(shí)摘除其腎上腺，觀察CRH的表達(dá)變化，研究糖皮質(zhì)激素與CRH的關(guān)系，為研究

7、揭示應(yīng)激的變化機(jī)理提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料和方法1.1 動物及分組 成年健康雄性Wistar大鼠90只， 200220g，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)，隨機(jī)分為12組，即穹窿切斷0、4、7、10d組、相應(yīng)假手術(shù)組和相應(yīng)正常組，每組5只，共60只，用于ELISA檢測。剩余大鼠隨機(jī)分為穹窿切斷并摘除腎上腺7d組、相應(yīng)假手術(shù)組和相應(yīng)正常組。每組10只，共30只，用于免疫組織化學(xué)和免疫印跡法各半。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 穹窿切斷動物模型將大鼠用戊巴比妥麻醉后，固定于江灣IC型腦立體定位儀，常規(guī)消毒、剪毛，正中切開頭皮，暴露出顱骨，于前囟后1.5mm，中線外左右1.0mm處

8、，用電動開顱器鑿開顱骨，切開硬腦膜，自制的雙刃刀置于上述部位的腦表面（相當(dāng)于穹窿部位），續(xù)降刀6mm，切斷穹窿，降刀時(shí)間約1min，假手術(shù)組降刀2mm（未切穹窿），刀在腦中均停留5min。清潔顱面，縫合頭皮，常規(guī)飼養(yǎng)，抗生素控制感染4。1.2.2 穹窿切斷并摘除腎上腺模型建立穹窿切斷動物模型后，將大鼠俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長的皮膚切口。在腎前內(nèi)側(cè)脊柱下方找到淡黃色的腎上腺并摘除, 同法摘除右側(cè)腎上腺(位置稍靠前) , 縫合肌肉和皮膚, 并涂以碘酊。假手術(shù)組進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相似的手術(shù)，但不摘除腎上腺。術(shù)后保持室溫為2125, 以葡萄糖、生理鹽水代替飲水5。1.3

9、ELISA 檢測血清糖皮質(zhì)激素水平 取穹窿切斷大鼠眼窩靜脈叢血液，每次采血0.5mL，消毒棉球壓迫眼球止血30s。采血后離心取血清，相應(yīng)反應(yīng)板孔中加入20L標(biāo)準(zhǔn)品，20L血清標(biāo)本，每板孔再加入200L酶聯(lián)物，室溫 60min。洗滌液洗滌反應(yīng)板，每孔加入100L顯色液，室溫溫育15min。每孔加入100L終止液。輕輕混勻30s；60min內(nèi)450nm處讀OD值，再換算成質(zhì)量濃度。1.4 免疫組織化學(xué)SABC法顯色 穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠施心灌流、固定，用恒冷箱切片機(jī)（型號Leica）制作冷凍切片，厚14m，3%H2O2甲醇20min、0.03% Triton X100浸泡10min，5BSA

10、封閉20min后，滴加CRH抗體（工作濃度為1:500），陰性對照組加0.01mol/L PBS代替一抗，4孵育過夜, 滴加二抗IgG 37、20min，滴加SABC 37、20min，DAB顯色, 脫水, 透明, 中性樹膠封片, 光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS, BX60, Japan）下觀察，攝片。1.5 免疫印跡法 取穹窿切斷并摘除腎上腺大鼠新鮮下丘腦組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，11000 r/min，取上清；每例標(biāo)本提取蛋白50g，7.5SDSPAGE變性凝膠電泳，濃縮膠80V，30min，分離膠120V，90min；轉(zhuǎn)印，40V，95min和100V，120min；TBS浸泡10

11、min，5%脫脂奶粉封閉60min，TTBS中洗2×5min；CRH一抗(工作濃度11000）中孵育4過夜；HRP標(biāo)記IgG（工作濃度11500）孵育2h，TTBS洗2×5min，TBS洗1×10min，HRPECL法顯色, dH2O漂洗，掃描膠片，Scion Image軟件分析。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS13.0 軟件處理，采用方差分析進(jìn)行兩兩比較，以 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 ELISA檢測結(jié)果 ELISA結(jié)果表明穹窿切斷后0、4d，糖皮質(zhì)激素的濃度無明顯變化，7d后糖皮質(zhì)激素濃度升高，10

12、d升高顯著（表1）。表1 各組大鼠血清糖皮質(zhì)激素的水平(略)2.2 CRH免疫組織化學(xué)反應(yīng)顯色結(jié)果 正常組及假手術(shù)組CRH免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕黃色斑塊狀，主要分布于室旁核神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。穹窿切斷并摘除腎上腺組下丘腦室旁核神經(jīng)元CRH的陽性表達(dá)（0.499±0.077）較正常組（0.387±0.065）、假手術(shù)組（0.379±0.082）明顯增高，CRH免疫反應(yīng)的平均光密度值升高，細(xì)胞染色變深，（P0.05）（圖1）。2.3 免疫印跡法結(jié)果 免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)下丘腦CRH的表達(dá)在穹窿切斷并摘除腎上腺組（91.21±8.73）與假手術(shù)組（43.83

13、7;4.16）、正常組（39.72±3.48）相比明顯升高（P0.05）（圖2）。3 討論 CRH是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),與機(jī)體的內(nèi)分泌、代謝、心血管功能、神經(jīng)化學(xué)和行為反應(yīng)密切相關(guān)。CRH 廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng), 但在應(yīng)激后僅在下丘腦室旁核表達(dá)增加6。下丘腦室旁核是HPA軸活動的直接控制部位。應(yīng)激狀態(tài)下, 室旁核分泌CRH經(jīng)正中隆起、垂體門脈系統(tǒng)作用于垂體前葉細(xì)胞上高度表達(dá)的CRHR1(CRH的I型受體),刺激垂體前葉合成、分泌ACTH,促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素，發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌功能7。 研究表明海馬對HPA軸有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。但是從海馬到室旁核沒有直接的神經(jīng)投射,間接路徑都匯聚

14、到穹窿, 由此可推斷海馬對HPA軸的調(diào)節(jié)作用可能是媒介穹窿對下丘腦旁核產(chǎn)生了抑制作用。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠穹窿切斷的模型，觀察到穹窿切斷7d后，CRH的表達(dá)升高。提示穹窿切斷后, 海馬對HPA軸的抑制作用減弱, 室旁核合成CRH 增多, HPA 軸活動增強(qiáng),證明了海馬可能通過穹窿對室旁核發(fā)揮抑制作用。但是CRH表達(dá)升高，HPA 軸活動增強(qiáng)的最終結(jié)果是糖皮質(zhì)激素的水平升高。為此，本實(shí)驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ)上建立了大鼠穹窿切斷的模型，檢測血中糖皮質(zhì)激素的濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穹窿切斷7 d后，糖皮質(zhì)激素的濃度升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了海馬通過穹窿對下丘腦室旁核發(fā)揮抑制作用。 現(xiàn)將穹窿切斷的動物并摘除腎上

15、腺，即在糖皮質(zhì)激素水平下降的情況下，觀察CRH的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，穹窿切斷并摘除腎上腺7d，CRH的表達(dá)升高。有研究表明當(dāng)糖皮質(zhì)激素的水平過高時(shí)，此激素能通過在下丘腦室旁核及其上游水平的調(diào)節(jié)而有效抑制CRH的釋放8。綜上結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素對CRH有負(fù)調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)為探討海馬抑制HPA軸的機(jī)制及研究應(yīng)激的變化機(jī)理提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Preil J, Muller MB, Gesing A, et al. Regulation of the hypothalamicpituitaryadrenocortical system in mice deficient for

16、 CRH receptors 1 and 2J. Endocrinology, 2001, 142 (11): 49464955.2 Fang H, Hong L, Yanhui Z, et al. Expression of hippocampal corticosteroid receptors, as well as corticotrophinreleasing hormone and vasopressin in the hy pothalamic paraventricular nucleus, in fornix transected ratsJ. Neural Regenera

17、tion Rearch，2009，4:325332.3 張彥慧，韓芳，石玉秀.大鼠海馬神經(jīng)元核受體鹽皮質(zhì)激素受體于穹窿切斷后表達(dá)的變化J. 解剖學(xué)雜志，2008，31（4）：522525.4 張彥慧，石玉秀，符皎榮，等.大鼠海馬神經(jīng)元核受體糖皮質(zhì)激素受體在穹窿切斷同時(shí)摘除腎上腺后表達(dá)的變化J. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2010，26（2）：161164.5 張彥慧，符皎榮，陸平. 腎上腺切除后大鼠下丘腦室旁核MR、GR表達(dá)變化的研究J. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，14（2）：105107.6 Imaki T, Katsumata H, Miyata M, et al.Expression of corticotrophin releasing hormone type 1 receptor in paraventricular nucleus after acute stressJ.Neuroendocrinology, 2001,73(5):293301.7 Fang Han. Colocali