全基因組重測序數(shù)據(jù)分析詳細說明

1、全基因組重測序數(shù)據(jù)分析1. 簡介(Introduction)通過高通量測序識別發(fā)現(xiàn)de novo的somatic和germ line 突變，結(jié)構(gòu)變異-SNV，包括重排突變（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；針對重排突變和SNP的功能性進行綜合分析；我們將分析基因功能（包括miRNA），重組率（Recombination）情況，雜合性缺失（LOH）以及進化選擇與mutation之間的關(guān)系；以及這些關(guān)系將怎樣使得在disease（cancer）genome中的mutation產(chǎn)生對應(yīng)的易感機制和功能。我們將在基因組學以及

2、比較基因組學，群體遺傳學綜合層面上深入探索疾病基因組和癌癥基因組。實驗設(shè)計與樣本（1）Case-Control 對照組設(shè)計 ；（2）家庭成員組設(shè)計：父母-子女組（4人、3人組或多人）；初級數(shù)據(jù)分析1數(shù)據(jù)量產(chǎn)出： 總堿基數(shù)量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads統(tǒng)計，測序深度分析。2一致性序列組裝：與參考基因組序列（Reference genome sequence）的比對分析，利用貝葉斯統(tǒng)計模型檢測出每個堿基位點的最大可能性基因型，并組裝出該個體基因組的一致序列。3SNP檢測及在基因組中的分布：提取全基因組中所有多態(tài)性位點，結(jié)合質(zhì)量值、測序深度、

3、重復(fù)性等因素作進一步的過濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對檢測到的變異進行注釋。4InDel檢測及在基因組的分布: 在進行mapping的過程中，進行容gap的比對并檢測可信的short InDel。在檢測過程中，gap的長度為15個堿基。對于每個InDel的檢測，至少需要3個Paired-End序列的支持。5Structure Variation檢測及在基因組中的分布: 能夠檢測到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有：插入、缺失、復(fù)制、倒位、易位等。根據(jù)測序個體序列與參考基因組序列比對分析結(jié)果，檢測全基因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對檢測到的變異進行注釋。高級數(shù)據(jù)分析1.測序短序列匹配（R

4、ead Mapping）（1）屏蔽掉Y染色體上假體染色體區(qū)域（pseudo-autosomal region）, 將Read與參考序列NCBI36進行匹配（包括所有染色體，未定位的contig，以及線粒體序列mtDNA（將用校正的劍橋參考序列做替代）)。采用標準序列匹配處理對原始序列文件進行基因組匹配， 將Read與參考基因組進行初始匹配；給出匹配的平均質(zhì)量得分分布；（2）堿基質(zhì)量得分的校準。我們采用堿基質(zhì)量校準算法對每個Read中每個堿基的質(zhì)量進行評分，并校準一些顯著性誤差，包括來自測序循環(huán)和雙核苷酸結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的誤差。（3）測序誤差率估計。 pseudoautosomal contigs，sh

5、ort repeat regions（包括segmental duplication，simple repeat sequence-通過tandem repeat識別算法識別）將被過濾；2. SNP Calling 計算 （SNP Calling）我們可以采用整合多種SNP探測算法的結(jié)果，綜合地，更準確地識別出SNP。通過對多種算法各自識別的SNP進行一致性分析，保留具有高度一致性的SNP作為最終SNP結(jié)果。這些具有高度一致性的SNP同時具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP識別算法包括基于貝葉斯和基因型似然值計算的方法，以及使用連鎖不平衡LD或推斷技術(shù)用于優(yōu)化SNP識別檢出的準確性。統(tǒng)計

6、SNV的等位基因頻率在全基因組上的分布稀有等位基因數(shù)目在不同類別的SNV中的比率分布（a）；SNV的類別主要考慮：（1）無義（nonsense）,（2）化學結(jié)構(gòu)中非同義，（3）所有非同義，（4）保守的非同義，（5）非編碼，（6）同義，等類型SNV； 另外，針對保守性的討論，我們將分析非編碼區(qū)域SNV的保守型情況及其分布（圖a, b）3. 短插入/缺失探測（Short Insertion /Deletion （Indel）Call）(1). 計算全基因組的indel變異和基因型檢出值的過程計算過程主要包含3步：（1）潛在的indel的探測；（2）通過局部重匹配計算基因型的似然值；（3）基于LD連

7、鎖不平衡的基因型推斷和檢出識別。Indel在X，Y染色體上沒有檢出值得出。(2). Indel 過濾處理4. 融合基因的發(fā)現(xiàn)（Fusion gene Discovery）選擇注釋的基因信息來自于當前最新版本的Ensemble Gene數(shù)據(jù)庫，RefSeq數(shù)據(jù)庫和Vega Gene數(shù)據(jù)庫。下面圖例給出的是融合基因的形成，即來自不同染色體的各自外顯子經(jīng)過重組形成融合基因的模式圖。5. 結(jié)構(gòu)變異（Structure Variation）結(jié)構(gòu)變異（Structure VariationSV）是基因組變異的一類主要來源，主要由大片段序列（一般>1kb）的拷貝數(shù)變異（copy number vari

8、ation, CNV）以及非平衡倒位（unbalance inversion）事件構(gòu)成。目前主要一些基因組研究探測識別的SV大約有20,000個（DGV數(shù)據(jù)庫）。在某些區(qū)域上，甚至SV形成的速率要大于SNP的速率，并與疾病臨床表型具有很大關(guān)聯(lián)。我們不僅可以通過測序方式識別公共的SV，也可以識別全新的SV。全新的SV的生成一般在germ line和突變機制方面都具有所報道。然而，當前對SV的精確解析需要更好的算法實現(xiàn)。同時，我們也需要對SV的形成機制要有更重要的認知，尤其是SV否起始于祖先基因組座位的插入或缺失，而不簡單的根據(jù)等位基因頻率或則與參考基因組序列比對判斷。SV的功能性也結(jié)合群體遺傳學

9、和進化生物學結(jié)合起來，我們綜合的考察SV的形成機制類別。SV形成機制分析，包括以下幾種可能存在的主要機制的識別發(fā)現(xiàn)：（A）同源性介導(dǎo)的直系同源序列區(qū)段重組（NAHR）；（B）與DNA雙鏈斷裂修復(fù)或復(fù)制叉停頓修復(fù)相關(guān)的非同源重組（NHR）；（C）通過擴展和壓縮機制形成可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）；（D）轉(zhuǎn)座元件插入（一般主要是長短間隔序列元件LINE/SINE或者伴隨TEI相關(guān)事件的兩者的組合）。結(jié)構(gòu)變異探測和擴增子（Amplicon）的探測與識別分析:如下圖所示6. 測序深度分析測序深度分析就是指根據(jù)基因組框內(nèi)覆蓋度深度與期望覆蓋度深度進行關(guān)聯(lián)，并識別出SV。我們也將采用不同算法識別原始

10、測序數(shù)據(jù)中的缺失片段（deletion）和重復(fù)片段（duplication）。7. SV探測識別結(jié)果的整合與FDR推斷(可選步驟)(1). PCR或者芯片方式驗證SV(2). 計算FDR-錯誤發(fā)現(xiàn)率（配合驗證試驗由客戶指定）(3) 篩選SV檢出結(jié)果用于SV的合并和后續(xù)分析：我們通過不同方式探測識別SV的目的極大程度的檢出SV，并且降低其FDR（<=10%）。通過下屬篩選方法決定后續(xù)分析所使用到的SV集合。每種SV探測識別算法得到的SV的FDR要求小于10%，并將各自符合條件的SV合并；對于FDR大于10% 的算法計算識別的SV結(jié)果，如果有PCR和芯片平臺驗證數(shù)據(jù)，同樣可以納入后續(xù)SV分析

11、中。最后，針對不同算法得到的SV，整合處理根據(jù)breakpoint斷點左右重合覆蓋度的置信區(qū)間來評定；8. 變異屬性分析(1) neutral coalescent分析測序數(shù)據(jù)可以探測到低頻率的變異體（MAF<=5%）。根據(jù)來自群體遺傳學理論（neutral coalescent理論）的期望值可以計算低頻度變異的分布。我們用不同等位基因頻率下每Mb變異數(shù)目與neutral coalescent 選擇下的期望值比值，即每Mb 基因組windows內(nèi)的theta觀測值，來刻畫和反映自然純化選擇與種群（cancer cell-line可以特定的認為是可以區(qū)分的種群）增長速率。該分布分別考察SN

12、P（藍色線），Indel（紅色線），具有基因型的大片段缺失（黑色線），以及外顯子區(qū)域上的 SNP（綠色線）在不同等位基因頻率區(qū)間上的theta情況（參見下圖）。 (2). 全新變異體(novel variant)的等位基因頻率和數(shù)量分布分析對象包括全新預(yù)測的SNP，indel，large deletion, 以及外顯子SNP在每個等位基因頻率類別下的數(shù)目比率（fraction）（參見下圖）；全新預(yù)測是指預(yù)測分析結(jié)果與dbSNP（當前版本129）以及deletion數(shù)據(jù)庫dbVar（2010年6月份版本）和已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)indels研究的基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過比較后識別確定的全新的SNP，indel以及

13、deletion。dbSNP包含SNP和indels; dbVAR包含有deletion,duplication,以及mobile element insertion。dbRIP以及其他基因組學研究（JC Ventrer 以及Watson 基因組，炎黃計劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的short indels和large deletion。(3). 變異體的大小分布以及新穎性分布計算SNP，Deletion，以及Insertion 大小分布；計算SNP，Deletion，以及Insertion中屬于全新預(yù)測結(jié)果的數(shù)目占已有各自參考數(shù)據(jù)庫數(shù)目的比例（相對于dbSNP數(shù)據(jù)庫；dbSNP包含SNP和ind

14、els;dbVAR包含有deletion,duplication,以及mobile element insertion。dbRIP以及其他基因組學研究（JC Ventrer 以及Watson 基因組，炎黃計劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的short indels和large deletion）其中，可以給出LINE，Alu的特征位置。(4). 結(jié)構(gòu)變異SV的斷點聯(lián)結(jié)點(BreakPoint Junction)分析根據(jù)SV不同檢出結(jié)果經(jīng)過一些列篩選步驟構(gòu)建所有結(jié)構(gòu)變異SV的斷點聯(lián)結(jié)點數(shù)據(jù)庫，保留長度大于等于50bp的SV；分析斷點聯(lián)結(jié)點處具有homology或者microhomology的SV；并將同

15、一染色體，起始和終止位置坐標下的不同SV進行去冗余處理。分析識別SV 的斷點聯(lián)結(jié)點（Breakpoint）: 將Breakpoint按照可能形成的方式可以分類為以下幾類：（a）非等位基因同源重組型（non-allelic homologous recombination-NAHR）;（b）非同源重組（nonhomologous recombination-NHR），包括nonhomologous end-joining (NHEJ)和fork stalling /template switching（FoSTeS/MMBIR）；（c）可變串聯(lián)重復(fù)（VNTR）（d）轉(zhuǎn)座插入元件（TEI）。圖 C

16、SV形成偏好性分析分析SV形成機制與斷裂點臨近區(qū)域序列的關(guān)系，包括染色質(zhì)界標（端粒，中心粒），重組高發(fā)熱點區(qū)域，重復(fù)序列以及含量，短DNA motif和微同源區(qū)域（microhomology region）。9.突變率估計針對以家庭成員為單位的測序方案，我們主要探測de novo的突變（DNM）；通過采用不同的方法/算法，我們給出每個家庭一份推斷的DNM報表；(1) 根據(jù)基因型推斷結(jié)果，分別對每人每堿基位置上的de novo突變進行綜合度量；(2) 采用貝葉斯方法計算家庭組設(shè)計中DNM的后驗概率10. SNP，SNV功能分析與注釋(1). 祖先等位基因的注釋通過將人類（NCBI36），黑猩猩（

17、chimpanzee2.1），猩猩（PPYG2）以及恒河猴（MMUL1）4種基因組進行基因組比對，發(fā)現(xiàn)保守的序列區(qū)域，計算祖先等位基因；以及duplication/deletion事件的進化分析。(2). 分析基因結(jié)構(gòu)序列上不同區(qū)域的多樣性（Diversity）與分歧進化（divergence）根據(jù)基因型分析結(jié)果計算基因結(jié)構(gòu)序列上的多樣性程度，即雜合度(heterozygosity); 雜合度指標可以說明選擇效應(yīng)的存在以及局部變異的結(jié)構(gòu)分布特征模式。我們將考慮基因5UTR上游200bp ，5UTR ，第一個外顯子，第一個內(nèi)含子，中間外顯子，中間內(nèi)含子，最末外顯子和內(nèi)含子，以及3UTR及其下游2

18、00bp區(qū)域左右考察的范圍(參見下圖a)。 分析編碼轉(zhuǎn)錄本的起始/終止位置臨近區(qū)域的多樣性和進化分歧度（參見下圖b）。(3). 疾病變異體探測將樣本測序中分析得到SV與HGMD疾病變異體數(shù)據(jù)進行比對，得到交叉記錄的錯義和無義的SNP；通過將HGMD疾病關(guān)聯(lián)突變與CUI（疾病概念分類標識數(shù)據(jù)庫）比對獲得HGMD中所有SV的疾病表型，并獲得HGMD與測序數(shù)據(jù)分析得到的SV的疾病表型；并通過Fisher檢驗和Bonferroni多重假設(shè)檢驗校正計算樣本SV所富集的疾病表型。(4). 拷貝數(shù)變異CNV所含基因的功能注釋將CNV是否覆蓋區(qū)段重復(fù)SD區(qū)域分類為2大類，每類CNV的所含基因的功能富集情況計算

19、，顯著性在橫軸表示；各種顯著性功能在縱軸表示。(5). 變異的功能性分析與注釋（a）. SNP, Indels以及大的結(jié)構(gòu)變異SV的功能注釋;（b）. 對包含翻譯起始注釋信息的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)上的SNP分類為：同義SNP，非同義SNP和無義SNP（引入終止子），干擾終止子的SNP，以及干擾剪接位點的SNP；為了降低假陽性，我們采用嚴格的篩選方式過濾來自indels的錯誤；（c）.對錯義編碼區(qū)突變的功能性分析: 通過信息學分析算法評估相對于生殖系變異的體細胞突變對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響效應(yīng)。(6). SNV，SNP與miRNA研究之間的關(guān)聯(lián)分析miRNA是起重要的調(diào)控作用的小分子，我們將對miRN

20、A的pri-mRNA，pre-miRNA以及miRNA靶基因序列進行分析，識別潛在的SNP功能位點。據(jù)文獻研究提供證據(jù)表明Human pre-miRNA的二級結(jié)構(gòu)中存在不同位置上的SNP，我們將通過熱力學穩(wěn)定性分析方法評估SNP對pre-miRNA結(jié)構(gòu)的影響；另外，我們也將對miRNA-Target靶基因相互作用位點做分析，評估對SNP對靶基因靶向性的影響。(7). SNV，SNP與GWAS研究之間的關(guān)聯(lián)分析分析GWAS研究中得到的易感基因在基因組上不同坐標上的OR值分布情況； 將當前已知的GWAS研究成果與SNP進行比較；根據(jù)LD連鎖不平衡將SNP與易感基因的關(guān)系進行深入討論;直接與間接關(guān)聯(lián)

21、方法可以分別識別與表型相關(guān)的SNP，對于不易獲得（missing）和定位的SNP，通過LD連鎖不平衡推斷疾病易感基因突變座位。(8) 生物學通路（代謝通路，信號通路）分析生物學通路（Biological pathway），包括代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物功能的重要組成部分，我們將各種形式的突變、變異，包括SNV和SNP，的對應(yīng)基因放到生物學通路中進行綜合分析，考察功能性突變對pathway的影響程度和影響的規(guī)律。通過GSEA（配合芯片表達譜數(shù)據(jù)），KS檢驗，超幾何分布檢驗等方法對變異基因在某些pathway的富集程度進行排序，識別發(fā)生功能改變的潛在通路。(9). 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI

22、）網(wǎng)絡(luò)分析蛋白質(zhì)相互作用也是生物分子功能增益和缺失的重要途徑，因此我們針對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的突變的蛋白及其收到影響的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點蛋白進行系統(tǒng)分析，并對收到影響的網(wǎng)絡(luò)子結(jié)構(gòu)進行功能注釋分析和聚類富分析。我們采用網(wǎng)絡(luò)分析算法對由于各種突變所受到影響的子網(wǎng)絡(luò)（subnetwork）進行功能富集度的分析；(10). 順式基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模塊（CRM）分析(a) 啟動子序列分析包括動子區(qū)域上的Motif預(yù)測，并與已知轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TRANSFAC和JASPAR中的TFBS結(jié)合位點進行比對；啟動子區(qū)域上保守性分析，分析突變位置和保守性區(qū)域的關(guān)聯(lián)；(b) 計算全基因組保守性。確定TFBS的保守性以及mutati

23、on位置的保守性；（11）重排（arrangements）與突變（mutation）的全基因組統(tǒng)計（a）. 體細胞(somatic)和生殖系（germline）重排（arrangements）體細胞突變是相對于germ line 突變的一類需要重要分析的內(nèi)容，我們針對Case-control設(shè)計的測序方案可以分別分析突變的情況，包括SNV，indel，以及CNV；如果僅在tumor/disease(Case組)出現(xiàn)而不在normal（對照組）出現(xiàn)的突變我們可以認為是somatic體細胞突變。將somatic mutation 與dbSNP數(shù)據(jù)庫比對可以發(fā)現(xiàn)潛在的全新的突變和有記錄的突變位置。然后，將突變分別比對到基因區(qū)域和非基因區(qū)域?；騾^(qū)域具體包括：內(nèi)含子區(qū)，UTR，剪接位點區(qū)和外顯子區(qū)。其中外顯子區(qū)分別統(tǒng)計：同義（synonymous），缺失（deletion），閱讀框移位（frameshift），插入（insertion）,錯義（missense）,無義（nonsense）以及非編碼蛋白外顯子（non-protein coding exon）等不同類型。綜合不同方面分析的結(jié)果，并按照突變分類給出各重排(arrangements)類型：SNV，CNV的數(shù)目統(tǒng)計數(shù)據(jù)表（參見下圖） 。對每一