儀器分析 紫外—可見分光光度法

1、儀儀 器器 分分 析析學(xué)學(xué) 習(xí)習(xí) 內(nèi)內(nèi) 容容（第（第 69 周）周）紫外紫外- -可見分光光度法（第可見分光光度法（第3 3章）章）分子發(fā)光分析法（第分子發(fā)光分析法（第5 5章）章）紅外光譜法（第紅外光譜法（第4 4章）章）分子分子?光譜光譜第第3 3章章 紫外紫外- -可見分光光度法可見分光光度法ultraviolet and visible spectrophotometry（UV-Vis） 3.1 紫外紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜3.2 光的吸收定律光的吸收定律3.3 紫外紫外- -可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)3.4 分析條件的選擇分析條件的選擇3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜法

2、的應(yīng)用可見吸收光譜法的應(yīng)用基本概念基本概念spectrum：復(fù)色光被色散系統(tǒng)分光后按照波長(zhǎng)或復(fù)色光被色散系統(tǒng)分光后按照波長(zhǎng)或頻率的大小依次排列的圖像。頻率的大小依次排列的圖像。 spectrumspectroscopic analysis：利用利用物質(zhì)的光譜物質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法。分析的方法。( (是以光與物質(zhì)的是以光與物質(zhì)的相互作相互作用用為基礎(chǔ)建立起來的儀器分析方法。為基礎(chǔ)建立起來的儀器分析方法。) )基本概念基本概念 250 500 基本概念基本概念 UV-Vis： 利用某些物質(zhì)利用某些物質(zhì)分子分子對(duì)對(duì)200200800nm800nm 光譜區(qū)域內(nèi)輻射

3、能的光譜區(qū)域內(nèi)輻射能的吸收吸收來研究物來研究物 質(zhì)的質(zhì)的性質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)和和含量含量的方法。的方法。UV-VisUV-Vis主要反映共軛體系和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征。主要反映共軛體系和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征。3.1 紫外紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜( (基本原理基本原理) ) 500 250鄰甲苯胺紫外鄰甲苯胺紫外-可見吸收光譜圖可見吸收光譜圖3.1 紫外紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜光的基本性質(zhì)；光的基本性質(zhì)；物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收；物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收；分子吸收光譜的形成；有機(jī)化合物的分子吸收光譜的形成；有機(jī)化合物的紫外紫外- -可見光譜；無機(jī)化合物的紫外可見光譜；無機(jī)化合物的紫

4、外- -可見光譜；可見光譜；紫外紫外- -可見光譜中的常用術(shù)語；可見光譜中的常用術(shù)語；影響紫外影響紫外- -可見吸收光譜的因素可見吸收光譜的因素 光的基本性質(zhì)光的基本性質(zhì)光是一種電磁波，具有波光是一種電磁波，具有波 粒二象性。粒二象性。 E h c / 波長(zhǎng)越長(zhǎng)，光量子能量越小，反之能量越大。波長(zhǎng)越長(zhǎng)，光量子能量越小，反之能量越大。E = hc/舉例：舉例：白光白光硫酸銅溶液硫酸銅溶液？色的光被吸收？色的光被吸收呈呈藍(lán)色藍(lán)色互補(bǔ)色光：如果兩種顏色的光按一定比例混合后互補(bǔ)色光：如果兩種顏色的光按一定比例混合后 可成為白色光，這兩種光稱互補(bǔ)色光。可成為白色光，這兩種光稱互補(bǔ)色光。（黃色）（黃色）

5、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收l是物質(zhì)與是物質(zhì)與輻射能輻射能相互作用的一種形式。相互作用的一種形式。l只有當(dāng)入射光的能量（只有當(dāng)入射光的能量（E）與吸光物質(zhì)）與吸光物質(zhì)分子從分子從基態(tài)基態(tài)躍遷到某一躍遷到某一激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)所需能量所需能量（E）相等相等時(shí)才會(huì)被吸收。時(shí)才會(huì)被吸收。 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài) E1 E = E 基基 態(tài)態(tài) E0躍遷幾率越大，物質(zhì)的躍遷幾率越大，物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)越大。越大。3.1.1 紫外紫外-可見分子吸收光譜的形成可見分子吸收光譜的形成 UV-Vis 是分子吸收光譜，它的產(chǎn)生可以是分子吸收光譜，它的產(chǎn)生可以 看做是

6、看做是分子對(duì)紫外分子對(duì)紫外- -可見光光子選擇性可見光光子選擇性俘獲俘獲 的過程，的過程，本質(zhì)上是分子內(nèi)價(jià)電子躍遷的結(jié)果。本質(zhì)上是分子內(nèi)價(jià)電子躍遷的結(jié)果。 分子的分子的價(jià)電子價(jià)電子在吸收電磁輻射并躍遷到高能在吸收電磁輻射并躍遷到高能級(jí)后所產(chǎn)生的吸收光譜，通常被稱為級(jí)后所產(chǎn)生的吸收光譜，通常被稱為電子光譜電子光譜，由于其波長(zhǎng)范圍是在光譜的由于其波長(zhǎng)范圍是在光譜的紫外和紫外和可見區(qū)可見區(qū)，所以，所以電子光譜又叫電子光譜又叫紫外紫外/ /可見光譜可見光譜。 紫外可見光譜的產(chǎn)生紫外可見光譜的產(chǎn)生3.1.1 紫外紫外-可見分子吸收光譜的形成可見分子吸收光譜的形成 分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)價(jià)電子運(yùn)動(dòng)價(jià)電子

7、運(yùn)動(dòng) Ee核的振動(dòng)核的振動(dòng) Ev分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng)分子繞其重心的轉(zhuǎn)動(dòng) Er E = Ee + Ev + Er Ee Ev Er帶狀光譜帶狀光譜線光譜線光譜 化合物的紫外化合物的紫外- -可見光譜決定于分子的可見光譜決定于分子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)和和分子軌道上分子軌道上電子電子的性質(zhì)。的性質(zhì)。300400500600700 /nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350 化合物分子的特征吸收波長(zhǎng)（化合物分子的特征吸收波長(zhǎng)（maxmax）決定于）決定于分子的分子的激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)與與基態(tài)基態(tài)之間的能量差。之間的能量差。3.1.2 有機(jī)化合物的紫外有機(jī)化

8、合物的紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜 O： n C H H H H * * * * n 與紫外與紫外-可見吸收光譜產(chǎn)生有關(guān)的電子：可見吸收光譜產(chǎn)生有關(guān)的電子：有機(jī)化合物分子內(nèi)電子躍遷類型有機(jī)化合物分子內(nèi)電子躍遷類型 * * n * * n * * * * 分子的分子的電子能級(jí)電子能級(jí)躍躍遷遷* * *n E3.1.2 有機(jī)化合物的紫外有機(jī)化合物的紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜（1） * * 躍遷：發(fā)生在遠(yuǎn)紫外區(qū)，實(shí)際應(yīng)用躍遷：發(fā)生在遠(yuǎn)紫外區(qū)，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。價(jià)值不大。例：甲烷例：甲烷max125nm.（2）n n * * 躍遷：含有未共享電子對(duì)的取代基躍遷：含有未共享電子對(duì)的取代基

9、都可能發(fā)生這一躍遷，所需能量取決于都可能發(fā)生這一躍遷，所需能量取決于n 電子所電子所屬原子的性質(zhì)。屬原子的性質(zhì)。例：碘甲烷例：碘甲烷max259nm.1. 飽和有機(jī)化合物飽和有機(jī)化合物3.1.2 有機(jī)化合物的紫外有機(jī)化合物的紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜 * 躍遷可發(fā)生在任何具有躍遷可發(fā)生在任何具有不飽和鍵不飽和鍵的的 有機(jī)化合物分子中。有機(jī)化合物分子中。特征是特征是較大，較大， 為強(qiáng)吸收（為強(qiáng)吸收（K K帶，共軛作用得名帶，共軛作用得名）。）。 n * 躍遷發(fā)生在含有躍遷發(fā)生在含有雜原子雙鍵雜原子雙鍵的不飽的不飽 和有機(jī)化合物中，和有機(jī)化合物中，吸收強(qiáng)度弱（吸收強(qiáng)度弱（R R 帶，雜原子

10、不飽和基團(tuán)得名帶，雜原子不飽和基團(tuán)得名）。）。2. 不飽和脂肪族化合物不飽和脂肪族化合物3.1.2 有機(jī)化合物的紫外有機(jī)化合物的紫外- -可見吸收光譜可見吸收光譜3. 芳香族化合物芳香族化合物E1和和E2是由苯環(huán)中的是由苯環(huán)中的 * * 躍遷產(chǎn)生，躍遷產(chǎn)生，B帶由苯得名，是芳香帶由苯得名，是芳香族化合物特征吸收帶。族化合物特征吸收帶。3.1.3 無機(jī)化合物的紫外無機(jī)化合物的紫外- -可見光譜可見光譜1. 電荷轉(zhuǎn)移光譜電荷轉(zhuǎn)移光譜 電荷轉(zhuǎn)移光譜電荷轉(zhuǎn)移光譜：某些無機(jī)配合物和有機(jī)物可產(chǎn)：某些無機(jī)配合物和有機(jī)物可產(chǎn) 生此類光譜生此類光譜,實(shí)質(zhì)是分子內(nèi)氧化還原過程；實(shí)質(zhì)是分子內(nèi)氧化還原過程； 其特點(diǎn)是

11、摩爾吸光系數(shù)大其特點(diǎn)是摩爾吸光系數(shù)大(104) ，用于定量分用于定量分 析可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。析可獲得較高的檢測(cè)靈敏度。3.1.3 無機(jī)化合物的紫外無機(jī)化合物的紫外- -可見光譜可見光譜 2. 配位體場(chǎng)吸收光譜配位體場(chǎng)吸收光譜 102, 位于可見光區(qū)，較少用于定量分析，位于可見光區(qū)，較少用于定量分析，可用于研究配合物的結(jié)構(gòu)及無機(jī)配合物可用于研究配合物的結(jié)構(gòu)及無機(jī)配合物鍵合理論。鍵合理論。3.1.4 紫外紫外- -可見光譜中的常用術(shù)語（可見光譜中的常用術(shù)語（P P2525自學(xué)）自學(xué)）吸收峰吸收峰谷谷肩峰肩峰末端吸收末端吸收吸收峰吸收峰 是指分子中產(chǎn)生吸收帶的主要官能團(tuán)；吸收帶是指分子中產(chǎn)生吸

12、收帶的主要官能團(tuán)；吸收帶的的max210nm, 屬于屬于* 、 n * 等躍遷類型。等躍遷類型。 生色團(tuán)為不飽和基團(tuán)：生色團(tuán)為不飽和基團(tuán)：C=CC=C、N=N-N=N-、C=OC=O、C=SC=S、-NO-NO2 2等；生色團(tuán)吸收帶的位置受相鄰取代基或溶劑等；生色團(tuán)吸收帶的位置受相鄰取代基或溶劑效應(yīng)的影響，吸收峰向長(zhǎng)波或短波移動(dòng)。效應(yīng)的影響，吸收峰向長(zhǎng)波或短波移動(dòng)。生色團(tuán)生色團(tuán) (chromophore)助色團(tuán)助色團(tuán)(auxochrome) 是指分子中一些帶有非成鍵電子的是指分子中一些帶有非成鍵電子的雜原子飽雜原子飽和基團(tuán)和基團(tuán), ,本身在紫外本身在紫外- -可見光區(qū)不產(chǎn)生吸收，但是可見光區(qū)不

13、產(chǎn)生吸收，但是當(dāng)它與生色團(tuán)連接后，使生色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波當(dāng)它與生色團(tuán)連接后，使生色團(tuán)的吸收帶向長(zhǎng)波移動(dòng)，且吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。移動(dòng)，且吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。-OH-OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-SH-SH、-Cl-Cl、-Br-Br、-I -I 等等 溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng)體系體系pHpH的影響的影響 3.1.5 影響紫外影響紫外- -可見光譜的因素可見光譜的因素共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)立體化學(xué)效應(yīng)立體化學(xué)效應(yīng)分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)分析條件分析條件核心是對(duì)分子核心是對(duì)分子中電子共軛結(jié)中電子共軛結(jié)構(gòu)的影響構(gòu)的影響UV-Vis主要反映共軛體系和主要反映共軛體系和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征芳香族化合物的結(jié)構(gòu)特征3.1.5 影

14、響紫外影響紫外- -可見光譜的因素可見光譜的因素1. 共軛效應(yīng)：共軛的共軛效應(yīng)：共軛的電子在整個(gè)共軛體電子在整個(gè)共軛體系內(nèi)流動(dòng)，屬于系內(nèi)流動(dòng)，屬于共軛基共軛基鏈上全部原子所鏈上全部原子所有，所以它們受到的束縛力較小，只要有，所以它們受到的束縛力較小，只要受到能量較低的輻射即可被激發(fā)。受到能量較低的輻射即可被激發(fā)。共軛體系越長(zhǎng)，最大吸收波長(zhǎng)越向長(zhǎng)波方向移共軛體系越長(zhǎng)，最大吸收波長(zhǎng)越向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，吸收強(qiáng)度也增強(qiáng)。動(dòng)，吸收強(qiáng)度也增強(qiáng)。3.1.5 影響紫外影響紫外- -可見光譜的因素可見光譜的因素2. 立體化學(xué)效應(yīng)立體化學(xué)效應(yīng)空間位阻空間位阻跨環(huán)效應(yīng)跨環(huán)效應(yīng)3.1.5 影響紫外影響紫外- -可見光譜

15、的因素可見光譜的因素物質(zhì)以氣態(tài)存在時(shí)的吸物質(zhì)以氣態(tài)存在時(shí)的吸收光譜收光譜 精細(xì)結(jié)構(gòu)；精細(xì)結(jié)構(gòu)；物質(zhì)在極性溶劑中的吸物質(zhì)在極性溶劑中的吸收光譜收光譜 溶劑化。溶劑化。3. 溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng)溶劑對(duì)吸收峰的位置、強(qiáng)度及光譜形狀均有影響溶劑對(duì)吸收峰的位置、強(qiáng)度及光譜形狀均有影響溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng) （1 1）溶劑極性對(duì)）溶劑極性對(duì) *躍遷的影響躍遷的影響 * * * * 能能 量量E非非 E極極水水 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙酮丙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 二氯甲烷二氯甲烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 己烷己烷 石油醚石油醚溶劑效應(yīng)溶劑效應(yīng) （2）溶劑極性對(duì)溶劑極性對(duì) n *躍遷的影響

16、躍遷的影響能能 量量* *n E非非* *nE極極（a a）苯酚的）苯酚的UVUV光譜圖光譜圖 （b b）苯胺的）苯胺的UVUV光譜圖光譜圖 4. 體系體系 pH pH 值對(duì)吸收帶的影響值對(duì)吸收帶的影響小小 結(jié)：結(jié)： UV-Vis涉及分子外層電子的能級(jí)躍遷；光涉及分子外層電子的能級(jí)躍遷；光 譜區(qū)域在譜區(qū)域在 200800nm； 有機(jī)、無機(jī)化合物紫外有機(jī)、無機(jī)化合物紫外- -可見光區(qū)電子躍遷可見光區(qū)電子躍遷 的類型；的類型； 影響紫外影響紫外-可見吸收光譜的因素?？梢娢展庾V的因素。 UV-Vis法是分子光譜分析法，利用的是法是分子光譜分析法，利用的是 分子對(duì)外來輻射的吸收特性；分子對(duì)外來輻射的

17、吸收特性；課后練習(xí)課后練習(xí)1.1.何為何為生色團(tuán)生色團(tuán)、助色團(tuán)？、助色團(tuán)？2.2.紫外吸收光譜法中，極性溶劑為什么會(huì)使紫外吸收光譜法中，極性溶劑為什么會(huì)使 * * 躍遷的吸收峰長(zhǎng)移，卻使躍遷的吸收峰長(zhǎng)移，卻使 * * 躍遷的吸收峰短移？躍遷的吸收峰短移？3.3.課后題課后題1 1、2 2（ P50 P50）本節(jié)參考書本節(jié)參考書 1. 分析化學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，參考分析化學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，參考“紫外紫外- -可見分光光度法的基本原理和概念可見分光光度法的基本原理和概念”的相關(guān)內(nèi)容。的相關(guān)內(nèi)容。 2.儀器分析，復(fù)旦大學(xué)出版社，參考第二章儀器分析，復(fù)旦大學(xué)出版社，參考第二章 “紫外紫外- -可見吸

18、收光譜法可見吸收光譜法”的相關(guān)內(nèi)容的相關(guān)內(nèi)容。 3. 無機(jī)化學(xué)，高等教育出版社，參考無機(jī)化學(xué)，高等教育出版社，參考“化學(xué)化學(xué)鍵與分子結(jié)構(gòu)鍵與分子結(jié)構(gòu)” ” 的內(nèi)容。的內(nèi)容。復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí) 紫外紫外-可見吸收光譜的形成；可見吸收光譜的形成； 有機(jī)物、無機(jī)物的紫外有機(jī)物、無機(jī)物的紫外-可見吸收光譜；可見吸收光譜； 影響紫外影響紫外-可見吸收光譜的因素可見吸收光譜的因素本次課內(nèi)容本次課內(nèi)容3.2 Lambert-Beers Law3.3 紫外紫外- -可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)3.2 Lambert-Beers Law （分光光度法定量分析的基礎(chǔ)）（分光光度法定量分析的基礎(chǔ)）選定波長(zhǎng)的入射光選定波長(zhǎng)的

19、入射光待測(cè)溶液待測(cè)溶液 A？c被測(cè)組分的含量被測(cè)組分的含量透射光透射光T3.2.1 3.2.2 T, A, Lambert-Beers Law IrI0ItIa I0 = Ia + It + Ir (1)3.2.1 3.2.2 T, A, Lambert-Beers Law I0 = Ia + It + Ir （1） I0 = Ia + It （2） T = It / I0 （3） A= -lgT （4） 如果在多組分溶液中，各組分間不存在相互作用，測(cè)得如果在多組分溶液中，各組分間不存在相互作用，測(cè)得的吸光度具有加和性。這一性質(zhì)是分光光度法測(cè)定混合組分的吸光度具有加和性。這一性質(zhì)是分光光度法測(cè)

20、定混合組分的依據(jù)。的依據(jù)。3.2.1 3.2.2 T, A, Lambert-Beers Law Lambert 定律描述了定律描述了A與與 l 的關(guān)系的關(guān)系 A= k l Beer定律描述了定律描述了A與與 c 的關(guān)系的關(guān)系 A= kc 實(shí)驗(yàn)證明，溶液對(duì)光的吸收程度實(shí)驗(yàn)證明，溶液對(duì)光的吸收程度( (A A) )與與c、l、有關(guān)。有關(guān)。Lambert-Beers Law 當(dāng)入射光當(dāng)入射光波長(zhǎng)波長(zhǎng)一定時(shí)，溶液對(duì)光的一定時(shí)，溶液對(duì)光的吸收吸收程度程度只與只與溶液濃度溶液濃度和和液層厚度液層厚度有關(guān)。有關(guān)。 A = k c l = -lgT = lgI0 / It (5)(5) 上式說明上式說明T與

21、與c, l 之間是指數(shù)函數(shù)的關(guān)系，之間是指數(shù)函數(shù)的關(guān)系，當(dāng)當(dāng)c增加一倍時(shí)，增加一倍時(shí)，T降至降至T2；而；而A與與c, l 之間是簡(jiǎn)之間是簡(jiǎn)單的正比關(guān)系。單的正比關(guān)系。3.2.3 吸光系數(shù)吸光系數(shù)-kn摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)n吸光系數(shù)吸光系數(shù)n百分吸光系數(shù)百分吸光系數(shù)K值物理意義：數(shù)值上等于吸光物質(zhì)在單位濃值物理意義：數(shù)值上等于吸光物質(zhì)在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度值。度和單位厚度時(shí)的吸光度值。 在給定在給定波長(zhǎng)、溶劑和溫度波長(zhǎng)、溶劑和溫度等條件下，等條件下， K是物是物質(zhì)特征常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)光的吸質(zhì)特征常數(shù)，表明物質(zhì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)光的吸收能力。收能力。12摩爾吸光系數(shù)（摩爾吸光

22、系數(shù)（） 當(dāng)當(dāng) l 以以 cm 表示，表示，c 以以 mol/L 表示表示時(shí)，時(shí)，k 值稱為摩爾吸光系數(shù)，用值稱為摩爾吸光系數(shù)，用表表示。單位是示。單位是 Lmol-1cm-1 。 A =l c摩爾吸光系數(shù)與靈敏度摩爾吸光系數(shù)與靈敏度是吸光物質(zhì)分子的一個(gè)是吸光物質(zhì)分子的一個(gè)特征常數(shù)特征常數(shù)，可作為估可作為估量定量分析方法靈敏度的指標(biāo)。量定量分析方法靈敏度的指標(biāo)。越大，改變?cè)酱螅淖儩舛榷鸬奈舛鹊母淖兙驮斤@著，測(cè)定的濃度而引起的吸光度的改變就越顯著，測(cè)定的靈敏度也就越高。靈敏度也就越高。提高摩爾吸光系數(shù)的方法提高摩爾吸光系數(shù)的方法分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)測(cè)量條件測(cè)量條件吸光系數(shù)（吸光系數(shù)（a） 當(dāng)

23、當(dāng) c 以以 g/L 表示時(shí)，表示時(shí)，k 值稱吸光系數(shù)，單值稱吸光系數(shù)，單位是：位是：Lg-1cm 1 。 A = a l c A1cm1% ( (百分吸光系數(shù)百分吸光系數(shù)) ) 一種吸光物質(zhì)的百分濃度為一種吸光物質(zhì)的百分濃度為1%（g/100ml）的溶的溶液在液在 1cm 吸收池中的吸光度。吸收池中的吸光度。 A= a1cm 1% l ca1cm 1% = 10 a = 10/ M （6）例例 題題用紫外用紫外- -可見分光光度法測(cè)定可見分光光度法測(cè)定Fe ，有下述兩種，有下述兩種方法。方法。A法：法：a = 1.97 X 10 2 Lg-1c-1 ;B法法: : = 4.10 X 103

24、Lmolc-1 .問：何種方法靈敏度高？問：何種方法靈敏度高？3.2.4 偏離偏離 Lambert-Beer Law 的因素的因素偏離偏離Lambert-Beer Law 的因素主要與的因素主要與樣品樣品（化學(xué)因素）（化學(xué)因素）和和儀器（光學(xué)因素）儀器（光學(xué)因素）有關(guān)。有關(guān)。 A = k c l1.1.與測(cè)定樣品溶液有關(guān)的因素與測(cè)定樣品溶液有關(guān)的因素A = klc當(dāng)c不變時(shí)不變時(shí) A與與l之間的線性關(guān)之間的線性關(guān)系普遍存在系普遍存在A = klc當(dāng)l不變時(shí)不變時(shí)c 0.01M 時(shí)時(shí), ,A與與c的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏差。差。吸收定律是一個(gè)有限的定律吸收定律是一個(gè)有限的定律(1)濃

25、度濃度為什么在為什么在 c 0.01M 時(shí)時(shí), ,A與與c的線性關(guān)系的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏差？會(huì)發(fā)生偏差？當(dāng)c 0.01M 時(shí)時(shí)當(dāng)c 0.01M 時(shí)時(shí)比爾定律在低濃度時(shí)正確，高濃度時(shí)受限。比爾定律在低濃度時(shí)正確，高濃度時(shí)受限。1.1.鄰近質(zhì)點(diǎn)彼此電荷分布鄰近質(zhì)點(diǎn)彼此電荷分布2.2.各組分之間的相互作用各組分之間的相互作用分子間的相互作用可分子間的相互作用可忽略不計(jì)忽略不計(jì)(2)溶溶 劑劑 由于待測(cè)物與溶劑發(fā)生締合、離解及溶劑化反由于待測(cè)物與溶劑發(fā)生締合、離解及溶劑化反 應(yīng)，產(chǎn)生的生成物與待測(cè)物具有不同的吸收光譜，應(yīng)，產(chǎn)生的生成物與待測(cè)物具有不同的吸收光譜，出現(xiàn)出現(xiàn)化學(xué)偏離化學(xué)偏離。(3)光散射的影

26、響光散射的影響當(dāng)試樣是膠體或有懸浮物時(shí)，入射光通過溶液后，當(dāng)試樣是膠體或有懸浮物時(shí)，入射光通過溶液后，有一部分光因散射而損失，使吸光度增大，對(duì)有一部分光因散射而損失，使吸光度增大，對(duì)Beer Law 產(chǎn)生產(chǎn)生正偏差正偏差。 2. 與儀器有關(guān)的因素與儀器有關(guān)的因素Lambert-Beer Law只適用于只適用于單色光單色光。單色光：是由單色器從連續(xù)光譜中分離出的一小單色光：是由單色器從連續(xù)光譜中分離出的一小段波長(zhǎng)范圍的段波長(zhǎng)范圍的復(fù)合光復(fù)合光，不是絕對(duì)的單色光不是絕對(duì)的單色光，有可，有可能造成對(duì)比爾定律的偏移。能造成對(duì)比爾定律的偏移。譜帶寬度（譜帶寬度（band width）：指具有某一波長(zhǎng)范圍

27、）：指具有某一波長(zhǎng)范圍 的光譜帶，常用半峰寬來表示。的光譜帶，常用半峰寬來表示。譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響 相同譜帶寬度的情況下，選擇哪一個(gè)譜帶寬度相同譜帶寬度的情況下，選擇哪一個(gè)譜帶寬度（波長(zhǎng)）作為測(cè)定波長(zhǎng)？（波長(zhǎng)）作為測(cè)定波長(zhǎng)？ 實(shí)驗(yàn)證明：選用一束吸光度隨波長(zhǎng)變化不大實(shí)驗(yàn)證明：選用一束吸光度隨波長(zhǎng)變化不大的復(fù)合光作為入射光進(jìn)行測(cè)定（的復(fù)合光作為入射光進(jìn)行測(cè)定（吸光物質(zhì)最大吸吸光物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)收波長(zhǎng)）。由于在此范圍內(nèi)，吸光物質(zhì)的）。由于在此范圍內(nèi)，吸光物質(zhì)的吸光系吸光系數(shù)變化不大數(shù)變化不大，對(duì)比爾定律造成的偏離較小，并能，對(duì)比爾定律造成的偏離較小，并能保證測(cè)定有較高的

28、靈敏度。保證測(cè)定有較高的靈敏度。譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響譜帶寬度對(duì)吸收定律的影響 圖示：圖示：AAc c譜帶譜帶A譜帶譜帶B譜帶譜帶A譜帶譜帶BA1A23.3 紫外紫外- -可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)UV-Vis spectrophotometer3.3.1 儀器主要部件及作用儀器主要部件及作用3.3.2 常用分光光度計(jì)類型及功能簡(jiǎn)介常用分光光度計(jì)類型及功能簡(jiǎn)介3.3.3 分光光度計(jì)的校正分光光度計(jì)的校正3.3.1 主要部件及作用主要部件及作用0.575光源光源單色單色器器吸收吸收池池檢測(cè)檢測(cè)器器顯顯示示3.3.2 分光光度計(jì)類型簡(jiǎn)介分光光度計(jì)類型簡(jiǎn)介1. 單波長(zhǎng)分光光度計(jì)單波長(zhǎng)分光光度計(jì)單

29、光束分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)2. 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)1. 單波長(zhǎng)分光光度計(jì)單波長(zhǎng)分光光度計(jì) 單光束分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì) 特點(diǎn)：只有一條光束特點(diǎn)：只有一條光束 單光束分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì) 不足：不足：要求光源和檢測(cè)系統(tǒng)必須要有較高的穩(wěn)定性；每要求光源和檢測(cè)系統(tǒng)必須要有較高的穩(wěn)定性；每更換一個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)，都要用空白溶液重新校準(zhǔn)。更換一個(gè)測(cè)定波長(zhǎng)，都要用空白溶液重新校準(zhǔn)。 實(shí)驗(yàn)：蘆丁含量測(cè)定；差示法測(cè)定樣品中高含量實(shí)驗(yàn)：蘆丁含量測(cè)定；差示法測(cè)定樣品中高含量鎳。鎳。752752型紫外型紫外- -可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì) 單波長(zhǎng)單波長(zhǎng)雙光束雙

30、光束分光光度計(jì)分光光度計(jì) 特點(diǎn)：在同一臺(tái)儀器中使用兩個(gè)特點(diǎn)：在同一臺(tái)儀器中使用兩個(gè)完全相同完全相同的光束。的光束。雙光束分光光度計(jì)雙光束分光光度計(jì)優(yōu)點(diǎn)：可自動(dòng)掃描樣品溶液吸收光譜；優(yōu)點(diǎn)：可自動(dòng)掃描樣品溶液吸收光譜；消除光源消除光源強(qiáng)度不穩(wěn)引入的誤差；強(qiáng)度不穩(wěn)引入的誤差；儀器開機(jī)后無須預(yù)熱可儀器開機(jī)后無須預(yù)熱可直接測(cè)樣；能減小放大器增益的漂移。直接測(cè)樣；能減小放大器增益的漂移。 島津島津 UV3101 UV3101 型型 吸光度測(cè)定吸光度測(cè)定 光譜掃描光譜掃描 時(shí)間光譜掃描時(shí)間光譜掃描功功能能雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì) 特點(diǎn)特點(diǎn)： 可將兩種不同波長(zhǎng)的可將兩種不同波長(zhǎng)的光交替通過同一樣品光交

31、替通過同一樣品 溶液，得到這兩個(gè)波溶液，得到這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光信號(hào)，再長(zhǎng)下的吸光信號(hào)，再通過適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換通過適當(dāng)?shù)男盘?hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為它們之間系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為它們之間的吸光度差的吸光度差 A A。 A = AA = A11 A A22 雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 不需要參比溶液；能不需要參比溶液；能夠減少背景吸收和干擾夠減少背景吸收和干擾吸收以及光源電壓變化吸收以及光源電壓變化產(chǎn)生的影響；可用于相產(chǎn)生的影響；可用于相互有干擾的多組分混合互有干擾的多組分混合物的分析。物的分析。島津島津 UV300 UV300 型型3.3.3 分光光度計(jì)的校正分光光度計(jì)的校正波長(zhǎng)校正：檢查儀波長(zhǎng)校正

32、：檢查儀器的波長(zhǎng)刻度與實(shí)器的波長(zhǎng)刻度與實(shí)際波長(zhǎng)是否能較好際波長(zhǎng)是否能較好的保持一致。用鐠的保持一致。用鐠釹玻璃或鈥玻璃釹玻璃或鈥玻璃3.3.3 分光光度計(jì)的校正分光光度計(jì)的校正吸光度校正：在實(shí)際工作中，有時(shí)需對(duì)儀器的吸光度校正：在實(shí)際工作中，有時(shí)需對(duì)儀器的吸光度標(biāo)度進(jìn)行檢查和校正。吸光度標(biāo)度進(jìn)行檢查和校正。用用 K2CrO4 標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收池校正：在吸收池吸收池校正：在吸收池A內(nèi)裝入試樣溶液，內(nèi)裝入試樣溶液，B內(nèi)內(nèi)裝入?yún)⒈热芤海瑴y(cè)吸光度；洗凈、調(diào)換兩種溶裝入?yún)⒈热芤海瑴y(cè)吸光度；洗凈、調(diào)換兩種溶液，再測(cè)吸光度。前后兩次測(cè)得吸光度差值應(yīng)液，再測(cè)吸光度。前后兩次測(cè)得吸光度差值應(yīng)小于小于1%。臨

33、床檢驗(yàn)常用臨床檢驗(yàn)常用分子光譜儀分子光譜儀 酶標(biāo)儀、全自動(dòng)生化分析儀、尿液分析酶標(biāo)儀、全自動(dòng)生化分析儀、尿液分析儀、血紅蛋白測(cè)定儀：專用分光光度計(jì)，工儀、血紅蛋白測(cè)定儀：專用分光光度計(jì)，工作原理均遵循朗伯作原理均遵循朗伯-比爾定律，采用比色法進(jìn)比爾定律，采用比色法進(jìn)行分析，儀器的核心都有一個(gè)行分析，儀器的核心都有一個(gè)“分光光度計(jì)分光光度計(jì)”。知識(shí)拓展知識(shí)拓展酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀是一臺(tái)變相的專用分光光度計(jì)；是酶聯(lián)免疫吸附是一臺(tái)變相的專用分光光度計(jì)；是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)專用儀器；利用比色法來分析抗原或抗體的實(shí)驗(yàn)專用儀器；利用比色法來分析抗原或抗體的含量。含量。 如：血清中乙肝病毒表面抗原、抗體的檢測(cè)。如：血

34、清中乙肝病毒表面抗原、抗體的檢測(cè)。全自動(dòng)生化分析儀全自動(dòng)生化分析儀 主要采用比色法進(jìn)行分析，工作波長(zhǎng)在主要采用比色法進(jìn)行分析，工作波長(zhǎng)在 340800nm之間；之間；通過對(duì)人體血液中脂類、酶類、蛋白通過對(duì)人體血液中脂類、酶類、蛋白質(zhì)、膽紅素等的分析來測(cè)定各種生化指標(biāo)；質(zhì)、膽紅素等的分析來測(cè)定各種生化指標(biāo)；是臨床是臨床最常用的檢驗(yàn)儀器之一。最常用的檢驗(yàn)儀器之一。尿液分析儀尿液分析儀 是檢測(cè)尿液中某些化學(xué)成分（是檢測(cè)尿液中某些化學(xué)成分（尿蛋白、葡萄尿蛋白、葡萄糖、膽紅素等糖、膽紅素等）含量的專用自動(dòng)化儀器；是反射）含量的專用自動(dòng)化儀器；是反射光比色計(jì)，采用球面積分儀接受雙波長(zhǎng)反射光，光比色計(jì)，采用

35、球面積分儀接受雙波長(zhǎng)反射光，檢測(cè)試紙帶顏色變化進(jìn)行定量分析。檢測(cè)試紙帶顏色變化進(jìn)行定量分析。血紅蛋白測(cè)定儀血紅蛋白測(cè)定儀 用光電器件測(cè)透射光強(qiáng)度，并與已定標(biāo)的血色用光電器件測(cè)透射光強(qiáng)度，并與已定標(biāo)的血色素值相比較，即可得出血紅蛋白含量；本質(zhì)是一臺(tái)素值相比較，即可得出血紅蛋白含量；本質(zhì)是一臺(tái)專用比色計(jì)。專用比色計(jì)。小小 結(jié)結(jié) Lambert-Beers Law 的數(shù)學(xué)表達(dá)式，吸光系數(shù)，的數(shù)學(xué)表達(dá)式，吸光系數(shù)，偏離定律的因素；偏離定律的因素； 紫外紫外-可見分光光度計(jì)各類型儀器特點(diǎn)?？梢姺止夤舛扔?jì)各類型儀器特點(diǎn)。習(xí)題：課后習(xí)題：課后3、5、9、15（P50）本節(jié)課參考書本節(jié)課參考書1.儀器分析復(fù)旦

36、大學(xué)出版社儀器分析復(fù)旦大學(xué)出版社2.最新儀器分析技術(shù)全書化學(xué)工業(yè)出版社最新儀器分析技術(shù)全書化學(xué)工業(yè)出版社3. 分析化學(xué)人民衛(wèi)生出版社分析化學(xué)人民衛(wèi)生出版社4. 全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程?hào)|南大學(xué)出版社全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程?hào)|南大學(xué)出版社復(fù)復(fù) 習(xí)習(xí) Lambert-Beers Law ，吸光系數(shù)，偏離定律的因，吸光系數(shù)，偏離定律的因素；素； 紫外紫外-可見分光光度計(jì)的主要部件，主要類型?？梢姺止夤舛扔?jì)的主要部件，主要類型。本次課內(nèi)容本次課內(nèi)容3.4 分析條件的選擇分析條件的選擇 3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜的應(yīng)用可見吸收光譜的應(yīng)用3.4 分析條件的選擇分析條件的選擇 3.4.1 儀器測(cè)量條件的選擇

37、儀器測(cè)量條件的選擇 3.4.2 反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇 3.4.3 參比溶液的選擇參比溶液的選擇 3.4.4 干擾及消除方法干擾及消除方法 3.4 分析條件的選擇分析條件的選擇提高方法的提高方法的靈敏度、準(zhǔn)確度靈敏度、準(zhǔn)確度儀器測(cè)量條件儀器測(cè)量條件 試樣反應(yīng)條件試樣反應(yīng)條件參比溶液參比溶液干擾及消除干擾及消除 3.4.1 儀器測(cè)量條件儀器測(cè)量條件 入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇雜散光的影響雜散光的影響透光率讀數(shù)的影響透光率讀數(shù)的影響（選擇合適的吸光度范圍）（選擇合適的吸光度范圍）入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇應(yīng)用應(yīng)用“最大吸收原則最大吸收原則”，在此波長(zhǎng)（，在此波長(zhǎng)（max）下）下測(cè)

38、定，吸光系數(shù)大，靈敏度高。測(cè)定，吸光系數(shù)大，靈敏度高。當(dāng)最大吸收峰峰形比較尖銳時(shí)，可選吸收稍低、當(dāng)最大吸收峰峰形比較尖銳時(shí)，可選吸收稍低、峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測(cè)定。峰形稍平坦的次強(qiáng)峰或肩峰進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)有干擾物存在時(shí)，可根據(jù)當(dāng)有干擾物存在時(shí)，可根據(jù)“吸收盡可能大，干吸收盡可能大，干擾盡可能小的原則擾盡可能小的原則”選擇入射光波長(zhǎng)。選擇入射光波長(zhǎng)。 雜散光的影響雜散光的影響 設(shè)雜散光強(qiáng)度為設(shè)雜散光強(qiáng)度為 Is , 測(cè)得吸光度為：測(cè)得吸光度為： A測(cè)測(cè) = lgI0+IsIt + IsIt I0 ， I0+Is It+Is I0 / It即即A測(cè)測(cè) A ，令令 Is / I0 = S, 有：

39、有： Is = S I0雜散光：指儀器內(nèi)部通過非預(yù)定途徑照射雜散光：指儀器內(nèi)部通過非預(yù)定途徑照射 到檢測(cè)器上的額外的光輻射。到檢測(cè)器上的額外的光輻射。 雜散光的影響雜散光的影響A測(cè)測(cè) = lgI0+ S I0It I0/I0+ S I0= lg1+ST+S例：當(dāng) S=1.0% ,T=10% ，求，求A測(cè)測(cè)？ 當(dāng) S=0 , T=10% ，求求A？當(dāng)當(dāng)S小于小于0.01%，可忽略雜散光的影響。，可忽略雜散光的影響。n任何分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量任何分光光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差誤差。 （這一誤差來源于光源、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)）（這一誤差來源于光源、檢測(cè)器、顯示系統(tǒng)）n這一測(cè)量誤差的這一測(cè)量誤差的總和

40、總和最終表現(xiàn)在透光率讀數(shù)最終表現(xiàn)在透光率讀數(shù)T T 上，上，設(shè)為設(shè)為T T。 透光率讀數(shù)的影響透光率讀數(shù)的影響 對(duì)同一臺(tái)儀器來說對(duì)同一臺(tái)儀器來說 ，T T 是一常數(shù)。但是一常數(shù)。但由于由于 A= - lgT ，所以在不同的透光率讀數(shù)范，所以在不同的透光率讀數(shù)范圍內(nèi)，同樣大小的圍內(nèi)，同樣大小的 T T 所引起的吸光度誤差所引起的吸光度誤差 A A 是不同的。是不同的。 透光率讀數(shù)的影響透光率讀數(shù)的影響 根據(jù)朗伯根據(jù)朗伯- -比爾定律：比爾定律：A 與與 c c 成正比關(guān)系成正比關(guān)系 因此，因此， A 與與 c 也成正比關(guān)系。也成正比關(guān)系。 A = = K c （ T、 A 、c 均為絕對(duì)誤差均為

41、絕對(duì)誤差 ） 測(cè)量結(jié)果的誤差通常用相對(duì)誤差來表示：測(cè)量結(jié)果的誤差通常用相對(duì)誤差來表示： c/c 透光率讀數(shù)的影響透光率讀數(shù)的影響c/c 與與 A 、T 的關(guān)系的關(guān)系 A = -lgTA = -lgT = l c c （1 1） (-0.434/T)dT=(-0.434/T)dT=l dc dc （2 2） 將（將（2 2）式代入）式代入朗伯朗伯- -比爾比爾定律，整理后得：定律，整理后得： 0.434 0.434 （3 3） T TlgTlgT c/c c/c = = T T c/cc/c與與 T T 的關(guān)系的關(guān)系 c/cc/c 36.8% T c/c =c/c =0.4340.434 T T

42、lgTlgT T T 0.434 Amin結(jié)結(jié) 論論1. c/c 取決于透光率取決于透光率T和透光率測(cè)量誤差和透光率測(cè)量誤差T的大的大小小; ; 當(dāng)當(dāng) T=36.8%時(shí)時(shí) ( (或或A=0.434)，c/c最小。最小。2. 當(dāng)當(dāng) T 讀數(shù)在讀數(shù)在 70% 10% , , 即即 A 讀數(shù)讀數(shù)0.15 1.0 范圍時(shí)范圍時(shí), , c/c 較小較小(5%)，并且變化不大。，并且變化不大。3.4.2 反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)：使待測(cè)物與顯色劑作用，生成有顏：使待測(cè)物與顯色劑作用，生成有顏色的化合物，色的化合物，顏色深淺與待測(cè)物濃度相關(guān)顏色深淺與待測(cè)物濃度相關(guān)，在在一定范圍內(nèi)呈直線

43、關(guān)系。一定范圍內(nèi)呈直線關(guān)系。目的目的：使被測(cè)組分在所選擇反應(yīng)條件下能有：使被測(cè)組分在所選擇反應(yīng)條件下能有效地轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于吸光度測(cè)定的化合物形態(tài)。效地轉(zhuǎn)變?yōu)檫m于吸光度測(cè)定的化合物形態(tài)。顯色反應(yīng)需滿足以下要求顯色反應(yīng)需滿足以下要求n反應(yīng)有較高的選擇性，生成物在紫外反應(yīng)有較高的選擇性，生成物在紫外- -可見可見光區(qū)有較強(qiáng)吸光能力。光區(qū)有較強(qiáng)吸光能力。n生成物組成恒定、穩(wěn)定性好，生成物組成恒定、穩(wěn)定性好，與被測(cè)物之間與被測(cè)物之間必須有確定的定量關(guān)系必須有確定的定量關(guān)系，顯色條件易于控制。，顯色條件易于控制。n對(duì)照性要好，顯色劑與生成物的最大吸收波對(duì)照性要好，顯色劑與生成物的最大吸收波長(zhǎng)差別要在長(zhǎng)差別要在

44、 60 nm 60 nm 以上。以上。反應(yīng)條件的選擇反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素影響顯色反應(yīng)的因素） 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) ：M + nR MRn 1. 顯色劑用量顯色劑用量：作吸光度隨顯色劑濃度變化：作吸光度隨顯色劑濃度變化曲線，選恒定吸光度值時(shí)的顯色劑用量。曲線，選恒定吸光度值時(shí)的顯色劑用量。 2. 同時(shí)還需考慮顯色反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性同時(shí)還需考慮顯色反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性和反應(yīng)的選擇性。和反應(yīng)的選擇性。反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）2. 溶液酸度的影響溶液酸度的影響：介質(zhì)酸度直接影響顯色：介質(zhì)酸度直接影響顯色劑離解程度，從而影響顯色反應(yīng)的完全程劑

45、離解程度，從而影響顯色反應(yīng)的完全程度。度。 固定溶液中待測(cè)組分與顯色劑的濃度，固定溶液中待測(cè)組分與顯色劑的濃度，改變?nèi)芤核岫龋ǜ淖內(nèi)芤核岫龋╬HpH值），測(cè)定溶液值），測(cè)定溶液A A與與 pH pH 的關(guān)系曲線，找出最適的關(guān)系曲線，找出最適 pH pH 范圍。范圍。反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）反應(yīng)條件的選擇（影響顯色反應(yīng)的因素）3.3.其他問題其他問題反應(yīng)的時(shí)間、溫度、放置的時(shí)間等。反應(yīng)的時(shí)間、溫度、放置的時(shí)間等。此外，加顯色劑和試劑的順序與實(shí)驗(yàn)成敗此外，加顯色劑和試劑的順序與實(shí)驗(yàn)成敗有重要關(guān)系！有重要關(guān)系！反應(yīng)條件的控制反應(yīng)條件的控制須通過實(shí)驗(yàn)確定顯色反應(yīng)最適宜條件。須通過實(shí)驗(yàn)確定顯

46、色反應(yīng)最適宜條件。對(duì)于已建立的比色方法，不應(yīng)隨意更改條件。對(duì)于已建立的比色方法，不應(yīng)隨意更改條件。需要改變條件，或新建方法中要考察某一條件需要改變條件，或新建方法中要考察某一條件對(duì)顯色的影響時(shí)，可通過實(shí)驗(yàn)描繪吸光度對(duì)顯色的影響時(shí)，可通過實(shí)驗(yàn)描繪吸光度-條件條件曲線，或不同條件下的吸光度曲線，或不同條件下的吸光度-濃度曲線，從中濃度曲線，從中選定適宜條件。選定適宜條件。3.4.3 參比溶液的選擇參比溶液的選擇溶劑參比：待測(cè)試樣組成簡(jiǎn)單，共存組分少且對(duì)測(cè)溶劑參比：待測(cè)試樣組成簡(jiǎn)單，共存組分少且對(duì)測(cè) 定波長(zhǎng)幾乎無吸收，可用溶劑做參比。定波長(zhǎng)幾乎無吸收，可用溶劑做參比。試劑參比試劑參比：在不加樣品的條

47、件下，加入所需試劑：在不加樣品的條件下，加入所需試劑 和溶劑。和溶劑。試樣參比：除不含顯色劑以外，其余成分都含有。試樣參比：除不含顯色劑以外，其余成分都含有。 平行操作參比：不含待測(cè)組分。平行操作參比：不含待測(cè)組分。3.4.4 干擾及消除方法干擾及消除方法 干擾物的影響：干擾物的影響：n干擾物本身有顏色或與顯色劑形成有色化干擾物本身有顏色或與顯色劑形成有色化合物；合物；n在顯色條件下，干擾物水解，析出沉淀使在顯色條件下，干擾物水解，析出沉淀使溶液渾濁；溶液渾濁；n與待測(cè)離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，與待測(cè)離子或顯色劑形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行。使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行。3.4.4 干擾

48、及消除方法干擾及消除方法 消除方法：消除方法：控制酸度，提高反應(yīng)的選擇性；控制酸度，提高反應(yīng)的選擇性；選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿?，但不能與待測(cè)選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿?，但不能與待測(cè)離子作用；離子作用；與待測(cè)物生成惰性配合物；與待測(cè)物生成惰性配合物；選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng)；選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng)；分離。分離。3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜的應(yīng)用可見吸收光譜的應(yīng)用 紫外紫外- -可見吸收光譜適用于不飽和有機(jī)可見吸收光譜適用于不飽和有機(jī)化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。利用紫外利用紫外- -可見吸收光譜進(jìn)行化合物的定性可見吸收光譜進(jìn)行化合物的定

49、性鑒別，一般采用鑒別，一般采用比較吸收光譜特征的方法。比較吸收光譜特征的方法。3.5.1 定性定性分析（鑒別）分析（鑒別）3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜的應(yīng)用可見吸收光譜的應(yīng)用3.5.1. 定性分析定性分析1. .對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)：max,max,或或A1cm1% 3.5.1. 定性分析定性分析2. 對(duì)比吸光度的比值對(duì)比吸光度的比值 有多個(gè)吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處有多個(gè)吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰處測(cè)得吸光度的比值作為鑒別依據(jù)。測(cè)得吸光度的比值作為鑒別依據(jù)。例：中國(guó)藥典規(guī)定，例：中國(guó)藥典規(guī)定，VitB12 在在361nm與與278nm吸吸光度的比值應(yīng)

50、為光度的比值應(yīng)為1.701.88， 361nm與與550 nm吸吸光度的比值應(yīng)為光度的比值應(yīng)為3.15 3.45.3.5.1. 定性分析定性分析3. 對(duì)比吸收光譜的一致性對(duì)比吸收光譜的一致性 將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配成相同濃度的溶液，將試樣與已知標(biāo)準(zhǔn)品配成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對(duì)其一在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對(duì)其一致性。致性。例：醋酸可的松、醋酸氫化可的松與醋酸潑尼例：醋酸可的松、醋酸氫化可的松與醋酸潑尼松三者有幾乎完全相同的松三者有幾乎完全相同的max,（240nm）、）、（1.57104）和）和A1cm 1% （390），），但它們的光但它們的光譜曲線有差別，據(jù)

51、此可得到鑒別。譜曲線有差別，據(jù)此可得到鑒別。3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜的應(yīng)用可見吸收光譜的應(yīng)用4.4.純度檢查純度檢查 雜質(zhì)檢查雜質(zhì)檢查雜質(zhì)的限量檢測(cè)雜質(zhì)的限量檢測(cè)3.5 紫外紫外- -可見吸收光譜的應(yīng)用可見吸收光譜的應(yīng)用3.5.2 結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析用于判別順反異構(gòu)用于判別順反異構(gòu)體和互變異構(gòu)體（可體和互變異構(gòu)體（可以確定一些化合物的以確定一些化合物的構(gòu)型和構(gòu)象）。構(gòu)型和構(gòu)象）。3.5.3 定量分析定量分析1. 單組分定量方法單組分定量方法 單組分：?jiǎn)谓M分： 樣品溶液中含一種組分，或者在混合物溶液樣品溶液中含一種組分，或者在混合物溶液中待測(cè)組分的吸收峰與其他共存物質(zhì)的吸收中待測(cè)組分的吸

52、收峰與其他共存物質(zhì)的吸收峰無重疊。峰無重疊。紫外紫外-可見吸收光譜常用于具有共軛體系的化可見吸收光譜常用于具有共軛體系的化合物的定量分析，靈敏度高，檢出限低。合物的定量分析，靈敏度高，檢出限低。(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 (calibration curve method) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列不同標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶 液，以不含被測(cè)組分空白溶液液，以不含被測(cè)組分空白溶液 為參比，分別測(cè)定其吸光度。為參比，分別測(cè)定其吸光度。 以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫 坐標(biāo)作圖。坐標(biāo)作圖。 A AxAx CxCxC吸光度吸光度- -濃度曲線濃度曲線 (2

53、) 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法 A =klc A/c = kl AS/cS = AX/cX即即: : cX = =AX.csAS1. 單組分定量方法單組分定量方法同種物質(zhì)、同臺(tái)儀器、同種物質(zhì)、同臺(tái)儀器、同一波長(zhǎng)，所以標(biāo)準(zhǔn)和同一波長(zhǎng)，所以標(biāo)準(zhǔn)和樣品的樣品的k和和l 相等。相等。方法簡(jiǎn)便，但誤差較標(biāo)準(zhǔn)曲線法大。方法簡(jiǎn)便，但誤差較標(biāo)準(zhǔn)曲線法大。2. 示差分光光度法示差分光光度法(高吸光度示差法高吸光度示差法) 原理原理: : 1.1.采用濃度比試樣含量稍低的采用濃度比試樣含量稍低的已知濃度已知濃度的的標(biāo)準(zhǔn)溶標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，液作為參比溶液，調(diào)調(diào)100% ；2. 然后測(cè)量一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液（其濃度均必須

54、然后測(cè)量一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液（其濃度均必須大于參比溶液的濃度）的吸光度和待測(cè)試樣溶大于參比溶液的濃度）的吸光度和待測(cè)試樣溶液的吸光度液的吸光度A（ A = Ax- As） ；3. 用比較法或工作曲線法求得待測(cè)溶液的濃度用比較法或工作曲線法求得待測(cè)溶液的濃度。2. 示差分光光度法示差分光光度法 以以A與與c做標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得相應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，查得相應(yīng)cx。 cx= cs + cx c cs s是參比溶液的濃度是參比溶液的濃度應(yīng)用：測(cè)定高含量組分應(yīng)用：測(cè)定高含量組分為什么示差分光光度法能準(zhǔn)確測(cè)量高含量組分？為什么示差分光光度法能準(zhǔn)確測(cè)量高含量組分？ 設(shè)：待測(cè)溶液濃度為設(shè)：待測(cè)溶液濃度為cx， 標(biāo)準(zhǔn)溶液（

55、參比溶液）濃度為標(biāo)準(zhǔn)溶液（參比溶液）濃度為 cs (cs cx)。1.采用普通光度法以采用普通光度法以試劑空白試劑空白為參比溶液分別測(cè)定為參比溶液分別測(cè)定二者的透光率。二者的透光率。假設(shè)：測(cè)得的待測(cè)溶液透光率為：假設(shè)：測(cè)得的待測(cè)溶液透光率為：Tx=5% 標(biāo)準(zhǔn)溶液（參比）透光率為：標(biāo)準(zhǔn)溶液（參比）透光率為： Ts = 10%2. 高含量組分測(cè)定高含量組分測(cè)定 示差分光光度法示差分光光度法2. 采用示差光度法以標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液測(cè)定，采用示差光度法以標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液測(cè)定，此時(shí)是用標(biāo)準(zhǔn)溶液將儀器的透光率調(diào)為此時(shí)是用標(biāo)準(zhǔn)溶液將儀器的透光率調(diào)為100%，然后再測(cè)定待測(cè)溶液的透光率。然后再測(cè)定待測(cè)溶液的

56、透光率。 此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液透光率為：此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液透光率為：Ts = 100% 那么測(cè)得的待測(cè)溶液透光率為：那么測(cè)得的待測(cè)溶液透光率為：Tx=50%2. 高含量組分測(cè)定高含量組分測(cè)定 示差分光光度法示差分光光度法普通光度法普通光度法: : cs: Ts=10%， cx: Tx=5%，示差法示差法: : cs: Ts =100%，cx: Tx=50%， 示差法示差法透光率的讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)大了十倍透光率的讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)大了十倍。使得。使得待測(cè)溶液透光率讀數(shù)落入適宜讀數(shù)范圍內(nèi)，提高待測(cè)溶液透光率讀數(shù)落入適宜讀數(shù)范圍內(nèi)，提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度。因此示差法了測(cè)量的準(zhǔn)確度。因此示差法能較準(zhǔn)確地測(cè)定高能較準(zhǔn)確地測(cè)定高含量組分。含量組分。3.