第五章酶分子修飾

1、酶分子修飾酶分子修飾 通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程。從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程。屬于酶分子工程的一部分。屬于酶分子工程的一部分。把酶分子中所含的金屬離子換成另一種金把酶分子中所含的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法。方法。常用的金屬離子常用的金屬離子CaCa2+2+，MgMg2+2+，MnMn2+2+，ZnZn2+2+，CoCo2+2+，CuCu2+2+，F(xiàn)eFe2+2+適用性適用性本來在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶。本來在結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶。（1

2、1）加入一定量的）加入一定量的EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）等金乙二胺四乙酸）等金 屬螯合物到酶液中，與酶分子中的金屬離子螯合；屬螯合物到酶液中，與酶分子中的金屬離子螯合；（2 2）通過透析、超濾、分子篩層析等方法，從）通過透析、超濾、分子篩層析等方法，從酶液中去除酶液中去除 EDTA- EDTA-金屬螯合物；金屬螯合物；（3 3）加入另一種金屬離子到酶液中，酶蛋白與）加入另一種金屬離子到酶液中，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合。新加入的金屬離子結(jié)合。、闡明金屬離子對酶催化作用的影響、闡明金屬離子對酶催化作用的影響、提高酶活力、提高酶活力鋅型蛋白酶置換成鈣型蛋白酶，酶活力可提高鋅型蛋白酶置換成鈣

3、型蛋白酶，酶活力可提高2020-30-30倍；制成晶體，倍；制成晶體，比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2 2-3-3倍。倍。、增強(qiáng)酶穩(wěn)定性、增強(qiáng)酶穩(wěn)定性天然含鐵超氧化物歧化酶中鐵原子被錳取代后天然含鐵超氧化物歧化酶中鐵原子被錳取代后, ,酶的穩(wěn)定性和抑制酶的穩(wěn)定性和抑制作用發(fā)生顯著改變作用發(fā)生顯著改變, ,重組的含錳酶對重組的含錳酶對H2O2H2O2的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng), ,對對NaH3NaH3的抑制作用的敏感性顯著降低。的抑制作用的敏感性顯著降低。、改變酶動(dòng)力學(xué)特性、改變酶動(dòng)力學(xué)特性?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鈷取代時(shí)?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鈷

4、取代時(shí), ,酶的底物專一性和酶的底物專一性和最適最適pHpH都有改變都有改變, ,鋅酶對鋅酶對N-N-氯氯- -乙酰丙氨酸的最適乙酰丙氨酸的最適pHpH是是8.5,8.5,而鈷酶的而鈷酶的最適最適pHpH是是7.0,7.0,并且對并且對N-N-氯氯- -乙酰丙氨酸等三種底物的活力降低，乙酰丙氨酸等三種底物的活力降低，m m增大，親和力降低。增大，親和力降低。 利用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，利用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法?；匦缘姆椒āＫ苄源蠓肿樱河倚囚?、聚乙二醇（水溶性大分子

5、：右旋糖酐、聚乙二醇（PEGPEG）、）、肝素、蔗糖聚合物等肝素、蔗糖聚合物等、修飾劑的選擇、修飾劑的選擇一、大分子結(jié)合修飾的方法一、大分子結(jié)合修飾的方法 大分子在使用前一般需經(jīng)過活化，活化基團(tuán)大分子在使用前一般需經(jīng)過活化，活化基團(tuán)才能在一定條件下與酶分子某側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)。才能在一定條件下與酶分子某側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)。、修飾劑的活化、修飾劑的活化 酶催化劑能力本質(zhì)上是由其特定的空間結(jié)構(gòu)特別酶催化劑能力本質(zhì)上是由其特定的空間結(jié)構(gòu)特別是其活性中心的特定構(gòu)象所決定是其活性中心的特定構(gòu)象所決定水溶性大分子通過共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合后可使酶水溶性大分子通過共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合后可使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性

6、中心更有的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性中心更有利于和底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，使酶活利于和底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，使酶活力提高。力提高。1 1分子核糖核酸酶與分子核糖核酸酶與6.56.5分子右旋糖酐結(jié)合，活力分子右旋糖酐結(jié)合，活力提高提高2.252.25倍。倍。二、大分子結(jié)合修飾的作用二、大分子結(jié)合修飾的作用酶的穩(wěn)定性較低是普遍存在的。采用大分子與酶的穩(wěn)定性較低是普遍存在的。采用大分子與酶結(jié)合，形成復(fù)合物，就可起到保護(hù)酶的天然酶結(jié)合，形成復(fù)合物，就可起到保護(hù)酶的天然構(gòu)象的作用，從而增加酶的穩(wěn)定性。構(gòu)象的作用，從而增加酶的穩(wěn)定性。表表5-1 天然天然SOD與修飾后與修飾后SOD在人

7、血漿中的半衰期在人血漿中的半衰期 酶酶 半衰期半衰期天然天然SOD右旋糖酐右旋糖酐-SODFicoll（低分子量）低分子量）-SODFicoll（高分子量）高分子量）-SOD聚乙二醇聚乙二醇-SOD 6min 7h 14h 24h 35h抗原抗原能引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。能引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。抗體抗體當(dāng)外源蛋白非經(jīng)口進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后，體當(dāng)外源蛋白非經(jīng)口進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后，體內(nèi)血清中就可能出現(xiàn)與此外源蛋白特異結(jié)合的物內(nèi)血清中就可能出現(xiàn)與此外源蛋白特異結(jié)合的物質(zhì)稱之為抗體。質(zhì)稱之為抗體。當(dāng)酶非經(jīng)口（如注射）進(jìn)入人體后，往往會成為當(dāng)酶非經(jīng)口（如注射）進(jìn)入人體后，往往會成為一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生

8、抗體。當(dāng)這種酶再次注一種抗原，刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗體。當(dāng)這種酶再次注射進(jìn)體內(nèi)時(shí)，抗體就會與作為抗原的酶特異地結(jié)射進(jìn)體內(nèi)時(shí)，抗體就會與作為抗原的酶特異地結(jié)合，使酶失去催化功能。用合，使酶失去催化功能。用PEGPEG修飾色氨酸酶可修飾色氨酸酶可完全消除該酶的抗原性。完全消除該酶的抗原性。采用一定的方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，采用一定的方法使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的修飾方法。從而改變酶的催化特性的修飾方法。用于研究酶分子結(jié)構(gòu)與功能：用于研究酶分子結(jié)構(gòu)與功能：（）熒光試劑修飾，了解酶水溶液中構(gòu)象；（）熒光試劑修飾，了解酶水溶液中構(gòu)象；（）各基團(tuán)對酶的影響，必需基團(tuán)；（）各基團(tuán)對酶

9、的影響，必需基團(tuán)；（）某基團(tuán)數(shù)量；（）某基團(tuán)數(shù)量；（）改變酶性能（）改變酶性能 其側(cè)鏈功能基團(tuán)有氨基、羧基、巰基、咪唑其側(cè)鏈功能基團(tuán)有氨基、羧基、巰基、咪唑基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等，基、吲哚基、酚羥基、羥基、胍基、甲硫基等，這些基團(tuán)可組成各種副鍵對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形這些基團(tuán)可組成各種副鍵對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定起重要作用。這些功能基團(tuán)發(fā)生改變，成和穩(wěn)定起重要作用。這些功能基團(tuán)發(fā)生改變，引起副鍵改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而引起副鍵改變，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而引起酶特性和功能的改變。引起酶特性和功能的改變。（1）氨基修飾氨基修飾（2）羧基修飾羧基修飾（）巰基修飾巰基

10、修飾（）（）胍基修飾胍基修飾（5）酚基修飾酚基修飾 （）咪唑基修飾（）咪唑基修飾（）吲哚基修飾（）吲哚基修飾（）分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)側(cè)鏈基團(tuán)修飾方法側(cè)鏈基團(tuán)修飾方法賴氨酸的賴氨酸的 -NH2以非質(zhì)子化形式存在時(shí)以非質(zhì)子化形式存在時(shí)親核反應(yīng)活性高，易被選擇性修飾。親核反應(yīng)活性高，易被選擇性修飾。三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）是是非常有效的氨基修飾劑。非常有效的氨基修飾劑。1、氨基的烷基化、氨基的烷基化反應(yīng)式反應(yīng)式2、氰酸鹽使氨基甲氨酰化，離子小，、氰酸鹽使氨基甲氨?；?，離子小，易接近要修飾的基團(tuán)。易接近要修飾的基團(tuán)。3、磷酸吡哆醛（、磷酸吡哆醛（PLP）4、多肽鏈多肽鏈N-末端殘基的化學(xué)

11、修飾：用于蛋末端殘基的化學(xué)修飾：用于蛋白質(zhì)序列分析。有白質(zhì)序列分析。有2，4二硝基氟苯二硝基氟苯（DNFB）法（法（sanger試劑）、丹磺酰氯試劑）、丹磺酰氯（DNS）法、苯異硫氰酸酯（法、苯異硫氰酸酯（PITC）法。法。碳二亞胺修飾酶的羧基已成為最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，碳二亞胺修飾酶的羧基已成為最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法，條件溫和。條件溫和。反應(yīng)式反應(yīng)式+巰基在維持亞基間相互作用和酶催化過程中巰基在維持亞基間相互作用和酶催化過程中起重要作用，具很強(qiáng)的親核性，在含半胱氨起重要作用，具很強(qiáng)的親核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。酸的酶分子中是最易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。1、烷基化試劑；、烷基化試劑；2、

12、馬來酰亞胺；、馬來酰亞胺；3、有機(jī)汞試劑；、有機(jī)汞試劑；4、5-5-二硫代二硫代-雙（雙（2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸）（DTNBDTNB，EllmanEllman試劑）試劑） 巰基修飾劑巰基修飾劑反應(yīng)式反應(yīng)式具兩個(gè)鄰位羰基的化合物，如丁二酮等，是修飾具兩個(gè)鄰位羰基的化合物，如丁二酮等，是修飾精氨酸殘基的重要試劑；精氨酸殘基的重要試劑；精氨酸殘基在結(jié)合帶有陰離子底物的酶活性中心精氨酸殘基在結(jié)合帶有陰離子底物的酶活性中心部位起重要作用。部位起重要作用。反應(yīng)式反應(yīng)式1 1、碘化法、碘化法2 2、硝化法、硝化法3 3、琥珀酰化法、琥珀酰化法酪氨酸殘基上含有酚基，酚基經(jīng)修飾后，引入負(fù)酪氨酸殘基上含有酚基，

13、酚基經(jīng)修飾后，引入負(fù)電荷，增加了對正電荷底物的結(jié)合力。電荷，增加了對正電荷底物的結(jié)合力。修飾方法：修飾方法：含兩個(gè)反應(yīng)活性部位的含兩個(gè)反應(yīng)活性部位的雙功能基團(tuán)，可在相隔雙功能基團(tuán)，可在相隔較近的兩個(gè)氨基酸殘基較近的兩個(gè)氨基酸殘基之間或其它分子間發(fā)生之間或其它分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，可使酶分子交聯(lián)反應(yīng)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)固?？臻g構(gòu)象更加穩(wěn)固。有同型雙功能試劑、異型雙功能試劑。有同型雙功能試劑、異型雙功能試劑。酶的催化功能主要決定于酶的活性中心構(gòu)象酶的催化功能主要決定于酶的活性中心構(gòu)象肽段作用肽段作用（1 1）在活性中心部位的，起催化作用；）在活性中心部位的，起催化作用；（2 2）在活性中心以外

14、部位，維持酶的空間構(gòu)象。）在活性中心以外部位，維持酶的空間構(gòu)象。肽鏈被水解后的情況肽鏈被水解后的情況（1 1）酶活性中心破壞，酶失去催化功能）酶活性中心破壞，酶失去催化功能（2 2）仍可維持酶活性中心的完整構(gòu)象，酶活力保持不）仍可維持酶活性中心的完整構(gòu)象，酶活力保持不變或損失不多變或損失不多（3 3）有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催）有利于活性中心與底物的結(jié)合并且形成準(zhǔn)確的催化部位，酶催化功能增強(qiáng)或酶活力提高化部位，酶催化功能增強(qiáng)或酶活力提高l利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)

15、發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。特性和功能的方法。l酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（從從N N端端失失去去4 44 4個(gè)個(gè)氨氨基基酸酸殘殘基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 將酶分子肽鏈上的某一個(gè)將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸置換成另一個(gè)氨基酸，氨基酸置換成另一個(gè)氨基酸，從而改變酶的催化特性的修飾從而改變酶的催化特性的修飾方法。方法。 置換的置換的氨基酸氨

16、基酸催化劑：酪氨酰催化劑：酪氨酰- -tRNAtRNA合成酶。合成酶。其第其第5151位蘇氨酸換成脯氨酸，對位蘇氨酸換成脯氨酸，對ATPATP的親和性提的親和性提高近高近100100倍，酶活力提高倍，酶活力提高2525倍。倍。例例酪氨酸酪氨酸 + tRNA酪氨酰酪氨酰-tRNA酪氨酰酪氨酰-tRNA合成酶合成酶、提高酶活力、提高酶活力、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。、酶專一性改變、酶專一性改變一、一、-干擾素的穩(wěn)定性干擾素的穩(wěn)定性（修飾后低溫保存半年，活性不變）。（修飾后低溫保存半年，活性不變）。干擾素含干擾素含3 3個(gè)半胱氨酸，其中個(gè)半胱氨酸，其中2 2個(gè)的巰基個(gè)的巰基連成二硫鍵，另一個(gè)

17、（連成二硫鍵，另一個(gè)（Cys-17Cys-17）游離游離, ,易與另一個(gè)干擾素的游離巰基結(jié)合失去易與另一個(gè)干擾素的游離巰基結(jié)合失去活性。用絲氨酸置換之活性。用絲氨酸置換之, ,使干擾素不生使干擾素不生成二聚體成二聚體, ,大大提高其穩(wěn)定性。大大提高其穩(wěn)定性。例例2原理原理方法方法 1、化學(xué)修飾法、化學(xué)修飾法、定點(diǎn)突變法、定點(diǎn)突變法蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程通過改造蛋白質(zhì)相對應(yīng)的基因中的堿通過改造蛋白質(zhì)相對應(yīng)的基因中的堿基排列次序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到基排列次序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克隆到寄主細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性寄主細(xì)胞中，通過基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)過

18、程。的蛋白質(zhì)的技術(shù)過程。1、新蛋白質(zhì)工程結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、新蛋白質(zhì)工程結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)2、突變基因的核苷酸序列的確定、突變基因的核苷酸序列的確定3、突變基因的獲得、突變基因的獲得4、新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生、新蛋白質(zhì)的產(chǎn)生蛋白質(zhì)工程的主要步驟蛋白質(zhì)工程的主要步驟實(shí)驗(yàn)操作大致步驟實(shí)驗(yàn)操作大致步驟(1)先測定酶的一級結(jié)構(gòu)先測定酶的一級結(jié)構(gòu)(2)用用X射線衍射分析測定其三維結(jié)構(gòu)射線衍射分析測定其三維結(jié)構(gòu)(3a)根據(jù)結(jié)構(gòu)信息選擇突變部位根據(jù)結(jié)構(gòu)信息選擇突變部位,即選定哪一個(gè)氨基即選定哪一個(gè)氨基酸殘基要被取代酸殘基要被取代;選選46個(gè)氨基酸殘基的寡肽序列個(gè)氨基酸殘基的寡肽序列,其其間含待取代的氨基酸殘基間含待取代的氨基酸殘基

19、(3b)用化學(xué)法合成由用化學(xué)法合成由1218個(gè)堿基組成并為所選寡肽的氨個(gè)堿基組成并為所選寡肽的氨基酸序列編碼的核苷酸序列基酸序列編碼的核苷酸序列,作為定位誘變的引物作為定位誘變的引物(4)找到找到(構(gòu)建構(gòu)建)單股質(zhì)粒單股質(zhì)粒,含有為所要蛋白質(zhì)編碼的基因含有為所要蛋白質(zhì)編碼的基因,作為定點(diǎn)突變的模板作為定點(diǎn)突變的模板(7)將這兩個(gè)基因分離并克隆將這兩個(gè)基因分離并克隆,最后產(chǎn)物是細(xì)胞轉(zhuǎn)化突最后產(chǎn)物是細(xì)胞轉(zhuǎn)化突變型變型,能合成突變體蛋白質(zhì)能合成突變體蛋白質(zhì),與母體蛋白質(zhì)僅有與母體蛋白質(zhì)僅有1個(gè)氨個(gè)氨基酸的差別基酸的差別,這個(gè)氨基酸就是事先選定的突變部位這個(gè)氨基酸就是事先選定的突變部位.(6)將異質(zhì)雙

20、鏈質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞將異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞,(如如E.coli).轉(zhuǎn)化為兩個(gè)同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為兩個(gè)同質(zhì)雙鏈質(zhì)粒,一個(gè)含的基因是天一個(gè)含的基因是天然蛋白質(zhì)編碼的然蛋白質(zhì)編碼的,另一個(gè)是為突變體編碼的另一個(gè)是為突變體編碼的(5)將引物與單鏈模板將引物與單鏈模板DNA配對配對,用各種用各種DNA聚聚合酶和合酶和DNA連接酶將引物延長連接酶將引物延長,形成互補(bǔ)鏈形成互補(bǔ)鏈,得得到共價(jià)閉合的雙鏈到共價(jià)閉合的雙鏈DNA,也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒也叫異質(zhì)雙鏈質(zhì)粒通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。改變，從而改變酶的某些特性

21、和功能的方法。特點(diǎn)特點(diǎn)（1 1）不改變酶的組成單位和基團(tuán)；）不改變酶的組成單位和基團(tuán)；（2 2）酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變；）酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變；（3 3）副鍵發(fā)生某些變化和重排。）副鍵發(fā)生某些變化和重排。效果效果（1 1）改變底物特異性。多肽酶經(jīng)高壓處理，有利）改變底物特異性。多肽酶經(jīng)高壓處理，有利于肽的合成反應(yīng)，降低了水解反應(yīng)的能力于肽的合成反應(yīng)，降低了水解反應(yīng)的能力（2 2）提高酶活力，降低最適溫度。高壓處理纖維）提高酶活力，降低最適溫度。高壓處理纖維素酶，素酶， 30 30-40-40O OC C，酶活提高酶活提高10%10%。、酶的活性中心研究、酶的活性中心研究、酶空間結(jié)構(gòu)研

22、究、酶空間結(jié)構(gòu)研究、酶作用機(jī)制研究、酶作用機(jī)制研究（）親和標(biāo)記法（）親和標(biāo)記法（）差示標(biāo)記法（）差示標(biāo)記法（）氨基酸置換法（）氨基酸置換法（）核苷酸置換法（）核苷酸置換法、降低或者消除酶抗原性、降低或者消除酶抗原性、增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性、增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性、提高工業(yè)用酶的活力、提高工業(yè)用酶的活力、增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性、增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性、改變酶的動(dòng)力學(xué)特性、改變酶的動(dòng)力學(xué)特性抗體是和抗原結(jié)合的物質(zhì)?？贵w是和抗原結(jié)合的物質(zhì)。抗體與靶分子精確匹配。抗體與靶分子精確匹配。產(chǎn)生高度特異性和親和性。產(chǎn)生高度特異性和親和性。免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生1081010個(gè)不同的抗體分個(gè)不同的抗體分子（

23、多樣性子（多樣性 ） 抗體結(jié)構(gòu)抗體結(jié)構(gòu) 抗體分子是由抗體分子是由兩條輕鏈兩條輕鏈( L鏈鏈)和和兩條重鏈兩條重鏈(H鏈鏈)通過鏈間二通過鏈間二硫鍵連接而成硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。的四肽鏈結(jié)構(gòu)。能否利用抗體的這些特性將抗體能否利用抗體的這些特性將抗體開發(fā)成象酶那樣的催化劑呢？開發(fā)成象酶那樣的催化劑呢？1969年，年， Jentcks根據(jù)根據(jù)Panling的化學(xué)反應(yīng)過渡的化學(xué)反應(yīng)過渡態(tài)理論預(yù)言，用過渡態(tài)類似物，作為半抗原，態(tài)理論預(yù)言，用過渡態(tài)類似物，作為半抗原，產(chǎn)生的抗體，產(chǎn)生的抗體，該抗體該抗體具有酶催化反應(yīng)的具有酶催化反應(yīng)的基本特基本特征。征。1986年年Science同時(shí)發(fā)表了兩篇來自由同

24、時(shí)發(fā)表了兩篇來自由Lemer和和Schultz分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)研究組的發(fā)現(xiàn)分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)研究組的發(fā)現(xiàn)具有具有酶催化能力的抗體酶催化能力的抗體研究報(bào)告，揭開研究抗研究報(bào)告，揭開研究抗體酶的體酶的熱潮熱潮。取得的成果：取得的成果：天然酶所催化的天然酶所催化的6種種酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)數(shù)十種類型數(shù)十種類型的常規(guī)反應(yīng)的抗體酶。包括酯、的常規(guī)反應(yīng)的抗體酶。包括酯、羧酸和酰胺鍵的水解，酰胺形成，光誘導(dǎo)裂羧酸和酰胺鍵的水解，酰胺形成，光誘導(dǎo)裂解和聚合，酯交換，等等。解和聚合，酯交換，等等。 抗體酶（抗體酶（abzyme）：是抗體的高度選擇性和酶）：是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一的高

25、效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性，也叫催化抗體予了酶的屬性，也叫催化抗體。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：1、反應(yīng)、反應(yīng)專一性專一性相當(dāng)于或超過自然酶反應(yīng)的專一相當(dāng)于或超過自然酶反應(yīng)的專一性，性，2、催化速度有的可達(dá)到自然酶催化的水平。但、催化速度有的可達(dá)到自然酶催化的水平。但一般來說比非催化反應(yīng)快一般來說比非催化反應(yīng)快 102106倍，比天然倍，比天然酶催化反應(yīng)酶催化反應(yīng)速度慢速度慢，僅為它的，僅為它的 10-4-10-2。革命尚未成功，同志仍需努力。革命尚未成功，同志仍需努力。 二、抗體酶的制備方法二、抗體酶的制

26、備方法 1. 誘導(dǎo)法誘導(dǎo)法 l 以以Pauling的穩(wěn)定過渡態(tài)理論為指導(dǎo)，的穩(wěn)定過渡態(tài)理論為指導(dǎo)，即酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過渡態(tài)，降即酶的催化在于能結(jié)合底物產(chǎn)生過渡態(tài)，降低能障（反應(yīng)的活化能）。低能障（反應(yīng)的活化能）。l 以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀互補(bǔ)構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過間隔鏈與載用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過間隔鏈與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對動(dòng)物進(jìn)行然后對

27、動(dòng)物進(jìn)行免疫免疫，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)，取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞分泌單克胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交，雜交細(xì)胞分泌單克隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得到抗體酶。隆抗體，經(jīng)篩選和純化，得到抗體酶。例例 ： Schultz研究小組以研究小組以羧酸二酯水解反應(yīng)羧酸二酯水解反應(yīng)的的過渡態(tài)類似物過渡態(tài)類似物對硝基苯磷酰膽堿對硝基苯磷酰膽堿作為半抗原，誘作為半抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生單克隆抗體，經(jīng)過篩選找到一株導(dǎo)產(chǎn)生單克隆抗體，經(jīng)過篩選找到一株MOPC167。使水解反應(yīng)速度加快使水解反應(yīng)速度加快 12 000倍。倍。 2. 抗體結(jié)合部位修飾法抗體結(jié)合部位修飾法 以底物為半抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)當(dāng)以底物為半抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)當(dāng)具有底物結(jié)合部位，然后在此抗體的結(jié)具有底物結(jié)合部位，然后在此抗體的結(jié)合部位上引入催化基團(tuán)。如果引入的催合部位上引入催化基團(tuán)。如果引入的催化基團(tuán)與底物結(jié)合部位取向正確、空間化基團(tuán)與底物結(jié)合部位取向正確、空間排布恰到好處，則應(yīng)產(chǎn)生高活