SSR分子標(biāo)記ppt

1、SSRSSR分子標(biāo)記分子標(biāo)記 胡玉龍胡玉龍M110107260M110107260SSR標(biāo)記的簡(jiǎn)介及原理SSR標(biāo)記的步驟及分析SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)SSR分子標(biāo)記123SSR （simple sequence repeat）SSR標(biāo)記簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat ，SSR），指的是基因組中由1-6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，長(zhǎng)度一般在200bp以下。 SSR標(biāo)記是一種通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性來(lái)鑒別生物內(nèi)在的核苷酸排布及其外在狀態(tài)表現(xiàn)規(guī)律的技術(shù)。SSR標(biāo)記的簡(jiǎn)介SSR分子標(biāo)記的分子學(xué)基礎(chǔ)分子標(biāo)記的分子學(xué)基礎(chǔ)微衛(wèi)星在真核

2、生物的基因組中的含量非常豐富，而且常常是隨機(jī)分布于核DNA中。微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復(fù)整倍性變異或重復(fù)單位序列中的序列有可能不完全相單位序列中的序列有可能不完全相同同，因而造成多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異揭示出來(lái)，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個(gè)體間的多態(tài)性，基于這一想法，人們發(fā)展了SSR標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記原理分子標(biāo)記原理l 根據(jù)兩端序列的保守性，設(shè)計(jì)引物；進(jìn)行PCR，電泳分離，染色顯帶以檢測(cè)、分析微衛(wèi)星序列多態(tài)性；并確定基因排布序列及表型，最終達(dá)到成功鑒定的目的。l 簡(jiǎn)而言之，就是通過(guò)對(duì)樣本就是通過(guò)對(duì)樣本DNA多態(tài)性的分

3、多態(tài)性的分析，從而來(lái)得到樣本析，從而來(lái)得到樣本DNA序列以及在遺傳性狀序列以及在遺傳性狀上的調(diào)控和差異。上的調(diào)控和差異。 SSR標(biāo)記原理示意圖標(biāo)記原理示意圖SSRSSR分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)SSRSSR在真核生物基因組中分布廣在真核生物基因組中分布廣多態(tài)性豐富多態(tài)性豐富其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序膠電泳分離時(shí)單堿基分辨率其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序膠電泳分離時(shí)單堿基分辨率高、遺傳信息量大高、遺傳信息量大SSRSSR通常為共顯性標(biāo)記通常為共顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，呈孟德?tīng)柺竭z傳具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性DNADNA用量少用量少PCRPCR擴(kuò)增的可重復(fù)性高擴(kuò)增的可重復(fù)性高 SSRSSR分子標(biāo)記的

4、劣勢(shì)分子標(biāo)記的劣勢(shì) 開(kāi)發(fā)和合成新的開(kāi)發(fā)和合成新的SSRSSR引物投入高、難度大引物投入高、難度大 現(xiàn)有的現(xiàn)有的SSRSSR標(biāo)記數(shù)量有限，不能標(biāo)記所有的功能標(biāo)記數(shù)量有限，不能標(biāo)記所有的功能基因基因 SSRSSR多態(tài)性的檢測(cè)和應(yīng)用很大程度上依賴多態(tài)性的檢測(cè)和應(yīng)用很大程度上依賴PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增的效果的效果 SSRSSR座位突變率高，對(duì)變異反應(yīng)非常敏感座位突變率高，對(duì)變異反應(yīng)非常敏感 相對(duì)比較費(fèi)時(shí)等等。相對(duì)比較費(fèi)時(shí)等等。SSR分子標(biāo)記的步驟分子標(biāo)記的步驟第一步第一步：DNA 提?。禾崛NA并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。第二步第二步：PCR : PCR體系： 模板DNA引物 氯化鎂 4

5、種dNTP混合物 PCR緩沖液 TaqDNA 聚合酶PCR反應(yīng)程序 ： 變性94 復(fù)性（或退火）50-62 延伸72 ，一般30-35個(gè)循環(huán)SSR分子標(biāo)記的步驟分子標(biāo)記的步驟第三步第三步：瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增質(zhì)量（1%-2%瓊脂糖凝膠）；擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離：一般用8%變性聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物 第四步第四步：染色（多采用銀染法）：A.銀染液的配制：固定液(100mL冰乙酸加水稀釋至1000mL)；染色液(1.3gAgNO3、15mL37甲醛，加水稀釋至1000mL)；顯色液(30gNa2CO3、15mL37甲醛02mL 20mg/mlNa2S203，加水稀釋至1000mL)；終止液(10冰乙酸

6、)。SSR分子標(biāo)記的步驟分子標(biāo)記的步驟B.銀染法操作： 固定30min去離子水洗滌30s，2次染色30min去離子水洗滌2次(每次不超過(guò)30S) 顯色至所要程度去離子水洗30s終止顯影。SSR分子標(biāo)記的步驟分子標(biāo)記的步驟第五步第五步：結(jié)果分析圖1為一對(duì)引物對(duì)多對(duì)玉米親本SSR電泳圖引物引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)二三一從有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查詢使用近緣種的引物構(gòu)建基因組文庫(kù),篩選SSR位點(diǎn)SSRSSR分子標(biāo)記分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù),篩選篩選SSR位點(diǎn)位點(diǎn)5錨定錨定PCR 分離分離SSR標(biāo)記標(biāo)記K可以跟任何核苷酸配對(duì)，V不能與A配對(duì)，R不能與G配對(duì)，其他核苷酸均可與它們配對(duì)。這樣，VRVRV五個(gè)堿基一起構(gòu)成了一個(gè)封閉堿基群。在P C R 過(guò) 程 中 ， 由 于VRVRV不能與GA配對(duì)，該引物與模板DNA結(jié)合的時(shí)候，就不會(huì)在(GA)n重復(fù)區(qū)滑動(dòng)，只會(huì)結(jié)合在如圖1所示的位置上，以保證SSR位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性不會(huì)丟失。Thank you !共顯性：說(shuō)白了就是可以分辨出純合的和雜合的。（如圖示）（如圖示） 對(duì)于RAPD是隨機(jī)引物，(可以理解只有正向引物，沒(méi)有反向引物。)因此，它擴(kuò)增出來(lái)的為引物結(jié)合位點(diǎn)到終點(diǎn)的長(zhǎng)度。當(dāng)然一條鏈上會(huì)有很多該引物結(jié)合位點(diǎn)，也就出現(xiàn)了很多