微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

1、微生物的純培養(yǎng)和微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)顯微技術(shù)微生物的基本特點(diǎn)：微生物的基本特點(diǎn)：小小t 在絕大多數(shù)情況下都是利用微生物的群體在絕大多數(shù)情況下都是利用微生物的群體 來研究其屬性；來研究其屬性；t 微生物的物種（菌株）一般也是以群體的微生物的物種（菌株）一般也是以群體的 形式進(jìn)行繁衍、保存；形式進(jìn)行繁衍、保存；培養(yǎng)技術(shù)在微生物學(xué)中具有重要意義！培養(yǎng)技術(shù)在微生物學(xué)中具有重要意義！在研究中所使用的微生物培養(yǎng)群體：在研究中所使用的微生物培養(yǎng)群體：培養(yǎng)物：培養(yǎng)物：在一定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的在一定的條件下培養(yǎng)、繁殖得到的 微生物群體。微生物群體?；旌吓囵B(yǎng)物混合培養(yǎng)物: :含有多種微生物的培養(yǎng)物；含有

2、多種微生物的培養(yǎng)物；純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物: :只有一種微生物的培養(yǎng)物；只有一種微生物的培養(yǎng)物；通常情況下只有純培養(yǎng)物才能提供可以通常情況下只有純培養(yǎng)物才能提供可以重復(fù)的結(jié)果重復(fù)的結(jié)果純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)！純培養(yǎng)技術(shù)是進(jìn)行微生物學(xué)研究的基礎(chǔ)！ 微生物個(gè)體微小的特點(diǎn)也微生物個(gè)體微小的特點(diǎn)也決定了決定了顯微技術(shù)是進(jìn)行微生物研究的另一項(xiàng)顯微技術(shù)是進(jìn)行微生物研究的另一項(xiàng)重要技術(shù)，因?yàn)榻^大多數(shù)微生物的個(gè)重要技術(shù)，因?yàn)榻^大多數(shù)微生物的個(gè)體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)只能通過顯微鏡體形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)只能通過顯微鏡才能進(jìn)行觀察和研究。才能進(jìn)行觀察和研究。微生物的基本特點(diǎn)：微生物的基本特點(diǎn)：小第一節(jié)第一節(jié) 微生物的

3、分離和純培養(yǎng)微生物的分離和純培養(yǎng) 從混雜的群體中分離特定的某一種微生物，從混雜的群體中分離特定的某一種微生物，是研究和利用微生物的第一步。是研究和利用微生物的第一步。一、無菌技術(shù)一、無菌技術(shù)t 用于分離、培養(yǎng)微生物的器具事先不含任用于分離、培養(yǎng)微生物的器具事先不含任 何微生物；何微生物；t 在轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)微生物時(shí)防止其它微生物的在轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)微生物時(shí)防止其它微生物的 污染；其污染；其自身也自身也 不污染環(huán)境不污染環(huán)境。1 1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌常用的器具：常用的器具： 試管、瓶子、培養(yǎng)皿等試管、瓶子、培養(yǎng)皿等1887年，年，R J Petri 發(fā)明發(fā)明 Pe

4、tri dish高溫干熱滅菌高溫干熱滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌試管、瓶子、培養(yǎng)皿等試管、瓶子、培養(yǎng)皿等常用的滅菌方法：常用的滅菌方法：1 1、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌、微生物培養(yǎng)的常用器具及其滅菌常用的器具：常用的器具：2 2、接種操作、接種操作無菌操作：無菌操作： 火焰附近（酒精燈、煤氣燈）進(jìn)行火焰附近（酒精燈、煤氣燈）進(jìn)行2 2、接種操作、接種操作無菌操作：無菌操作：在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進(jìn)行下進(jìn)行二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基；二、用固

5、體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基；瓊脂瓊脂二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)菌落菌落（colony）：）： 單個(gè)（或聚集在一起的一團(tuán)）微生物在適單個(gè)（或聚集在一起的一團(tuán)）微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、程度可以形成肉眼可見的、 有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體的子細(xì)胞生長群體. .眾多菌落連成一片眾多菌落連成一片菌苔菌苔（lawn）不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)

6、定的特征（形狀、顏色等），可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類、鑒定的重要依據(jù)。（各種微生物形成的菌落特征各種微生物形成的菌落特征）同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落不同的特征菌落二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)使微生物在固體培養(yǎng)基平板上形成使微生物在固體培養(yǎng)基平板上形成單個(gè)菌落的基本方法：單個(gè)菌落的基本方法：稀釋稀釋二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)2 2、稀釋倒平板法、稀釋倒平板法1 1、涂布平板法、涂布平板法操作較麻煩操作較麻煩,對(duì)好對(duì)好氧菌、熱敏感菌氧菌、熱敏感菌效果不好效果不好使用較多的常使用較多的常規(guī)方法，但有規(guī)方

7、法，但有時(shí)涂布不均勻時(shí)涂布不均勻二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)3 3、平板劃線法、平板劃線法二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)4 4、厭氧微生物的分離、厭氧微生物的分離厭氧罐厭氧罐厭氧手套箱厭氧手套箱二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)4 4、厭氧微生物的分離、厭氧微生物的分離稀釋搖管法稀釋搖管法23三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)0.0480.048 + 0.0012 + 0.0002= 0.975 稀釋法進(jìn)行液體分離必須在同一個(gè)稀釋度稀釋法進(jìn)行液體分離必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中的許多平行試管中, ,大多數(shù)大

8、多數(shù)（一般應(yīng)超過一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。表現(xiàn)為不生長。例如例如: :若同一稀釋度的試管中有若同一稀釋度的試管中有95%95%表現(xiàn)為不生長，表現(xiàn)為不生長，則生長的試管中僅則生長的試管中僅含一個(gè)細(xì)胞的幾率為含一個(gè)細(xì)胞的幾率為: : 4.8% 含二個(gè)細(xì)胞的幾率為含二個(gè)細(xì)胞的幾率為: : 0.12% 含三個(gè)細(xì)胞的幾率為含三個(gè)細(xì)胞的幾率為: : 0.002%在有細(xì)菌生長的在有細(xì)菌生長的試管試管中得到純培養(yǎng)的幾率為中得到純培養(yǎng)的幾率為97.5%1878年，年，Lister 分離乳酸鏈球菌時(shí)所使用的分離乳酸鏈球菌時(shí)所使用的微量注射器和酒杯培養(yǎng)裝置微量注射器和酒杯培養(yǎng)裝置注射器的最小注射器的最小吸取量

9、吸取量: :0.00062 毫升毫升四、單細(xì)胞（孢子）分離四、單細(xì)胞（孢子）分離t 一般采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行；一般采用顯微操作儀，在顯微鏡下進(jìn)行；t 操作難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比；操作難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比；五、選擇培養(yǎng)分離五、選擇培養(yǎng)分離t 抑制大多數(shù)其它微生物的生長；抑制大多數(shù)其它微生物的生長；t 使待分離的微生物生長更快；使待分離的微生物生長更快；使待分離的微生物在群落中的數(shù)量使待分離的微生物在群落中的數(shù)量上升上升,方便用稀釋法對(duì)其進(jìn)行純化方便用稀釋法對(duì)其進(jìn)行純化.微生物群落中數(shù)量占少數(shù)的微生物的分離純化微生物群落中數(shù)量占少數(shù)的微生物的分離純化 沒有一種培養(yǎng)基或一種培

10、養(yǎng)條件能夠滿足自然界中沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足自然界中 一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基一切生物生長的要求，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。都是選擇性的。t 使待分離的微生物生長使待分離的微生物生長“突出突出”；直接挑取待分離的微生物的菌落獲得純培養(yǎng)直接挑取待分離的微生物的菌落獲得純培養(yǎng).五、選擇培養(yǎng)分離五、選擇培養(yǎng)分離1. 1. 利用選擇平板進(jìn)行直接分離利用選擇平板進(jìn)行直接分離待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制待分離的微生物生長，其它微生物的生長被抑制t 高溫下培養(yǎng)高溫下培養(yǎng): :分離嗜熱細(xì)菌分離嗜熱細(xì)菌t 培養(yǎng)基中不含培養(yǎng)基中不含N:分離固氮菌分離固氮

11、菌t 培養(yǎng)基加抗生素培養(yǎng)基加抗生素:分離抗性菌分離抗性菌五、選擇培養(yǎng)分離五、選擇培養(yǎng)分離1. 1. 利用選擇平板進(jìn)行直接分離利用選擇平板進(jìn)行直接分離待分離的微生物的生長特征待分離的微生物的生長特征明顯不同于其它微生物明顯不同于其它微生物 顏色反應(yīng)顏色反應(yīng): :分離特定的菌株分離特定的菌株牛奶平板牛奶平板: :分離蛋白酶產(chǎn)生菌分離蛋白酶產(chǎn)生菌 利用特定細(xì)菌的滑動(dòng)特點(diǎn)利用特定細(xì)菌的滑動(dòng)特點(diǎn) 進(jìn)行分離純化進(jìn)行分離純化；五、選擇培養(yǎng)分離五、選擇培養(yǎng)分離2. 2. 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)從自然界中分離到所需的特定微生物從自然界中分離到所需的特定微生物特定的環(huán)境條件特定的環(huán)境條件僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長僅

12、適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加待分離微生物在群落中的數(shù)量大大增加2. 2. 富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之是微生物學(xué)家最強(qiáng)有力的技術(shù)手段之一一.營養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無窮盡的組合形式營養(yǎng)和生理?xiàng)l件的幾乎無窮盡的組合形式可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要可應(yīng)用于從自然界選擇出特定微生物的需要.根據(jù)微生物的特殊要求根據(jù)微生物的特殊要求,從自然界分離出特定已知從自然界分離出特定已知微生物種類；微生物種類；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長的微生物；分離培養(yǎng)在特定環(huán)境中能生長的微生物；六、二元培養(yǎng)物六、二元培養(yǎng)物 培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而

13、且是有意培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。二元培養(yǎng)物。t 病毒和宿主細(xì)胞；病毒和宿主細(xì)胞；t 纖毛蟲、變形蟲和粘細(xì)菌；七、微生物的保藏技術(shù)七、微生物的保藏技術(shù)（見第九章（見第九章 微生物的遺傳變異與育種）微生物的遺傳變異與育種）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作程序微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)操作程序第二節(jié)第二節(jié) 顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡和顯微技術(shù)幾個(gè)基本概念：幾個(gè)基本概念：放大放大 分辨率分辨率 反差反差被觀察物越小被觀察物越小,放大倍數(shù)應(yīng)越大放大倍數(shù)應(yīng)越大,否則難否則難以看清以看清能辨別兩點(diǎn)之間最小距離的能力能辨別兩點(diǎn)之

14、間最小距離的能力被觀察物區(qū)別于背景的程度被觀察物區(qū)別于背景的程度與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，但也取決于進(jìn)行與顯微鏡的自身特點(diǎn)有關(guān)，但也取決于進(jìn)行顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)顯微觀察時(shí)對(duì)顯微鏡的正確使用及良好的標(biāo)本制作和觀察技術(shù)，這就是本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)顯微技術(shù)。一、顯微鏡的種類及原理一、顯微鏡的種類及原理1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡簡單顯微鏡簡單顯微鏡復(fù)式顯微鏡復(fù)式顯微鏡一、顯微鏡的種類及原理一、顯微鏡的種類及原理1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？光學(xué)顯微鏡一般配置的最大放大倍數(shù)是多少？為什么？為什么？如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯

15、微鏡一般配置最大放大倍數(shù)？如何實(shí)現(xiàn)光學(xué)顯微鏡一般配置最大放大倍數(shù)？其原理？其原理？目鏡：目鏡：10 15 物鏡：物鏡： 100 總放大倍數(shù)總放大倍數(shù)10001500 使用油鏡使用油鏡, ,即在即在100 物鏡和載玻片之間物鏡和載玻片之間滴加香柏油；滴加香柏油； 0.5 l l分辨率（最小可分辨距離）分辨率（最小可分辨距離）= = n sin q q1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡分辨率與所用分辨率與所用波長波長(l)l)成反比成反比1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 0.5 l l分辨率（最小可分辨距離）分辨率（最小可分辨距離）= = n sin q qq q為物鏡鏡口角的半數(shù)為

16、物鏡鏡口角的半數(shù),它取決于物鏡的直徑它取決于物鏡的直徑和工作距離和工作距離1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡 0.5 l l分辨率（最小可分辨距離）分辨率（最小可分辨距離）= = n sin q qn: :玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率顯微觀察時(shí)可根據(jù)物鏡的特性選用不同介質(zhì)顯微觀察時(shí)可根據(jù)物鏡的特性選用不同介質(zhì)空氣空氣 ( (n=1.0) n=1.0) 水水 ( (n=1.33)n=1.33)、香柏油香柏油 ( (n=1.52) n=1.52) 玻璃玻璃 ( ( n=1.54)n=1.54)1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡光線在穿過折射率不同的介質(zhì)時(shí)發(fā)生折射光線

17、在穿過折射率不同的介質(zhì)時(shí)發(fā)生折射1. 1. 普通光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡玻璃透鏡的工作原理玻璃透鏡的工作原理 很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡射而損失的光線可以進(jìn)入物鏡,使照明亮度提使照明亮度提高高,改善觀察效果。改善觀察效果。用浸沒油取代空氣的作用：用浸沒油取代空氣的作用：介質(zhì)折射率提高介質(zhì)折射率提高數(shù)值孔徑值和分辨率數(shù)值孔徑值和分辨率均得到提高均得到提高浸沒油與玻璃的折射率相近浸沒油與玻璃的折射率相近物物鏡鏡特特性性搜索物鏡低倍鏡高倍鏡油鏡放放大大倍倍數(shù)數(shù)41040-4590-100數(shù)數(shù)值值孔孔徑徑值值0.100.250

18、.55-0.651.25-1.4焦焦距距（f）40 mm16 mm4 mm1.8-2.0 mm工工作作距距離離17-20 mm4-8 mm0.5-0.7 mm0.1 mm450nm光光源源（藍(lán)藍(lán)光光）時(shí)時(shí)的的分分辨辨率率2.3 m0.9 m0.35 m0.18 m光學(xué)顯微鏡物鏡的特性人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 mm左右左右,因此因此光學(xué)顯微光學(xué)顯微鏡鏡的最大的最大有效放大倍數(shù)有效放大倍數(shù)（使用油鏡使用油鏡）是是1,000到到1,500。普通光學(xué)顯微鏡即普通光學(xué)顯微鏡即: :明視野顯微鏡明視野顯微鏡其照明光線直接進(jìn)其照明光線直接進(jìn)入視野入視野, ,屬透射照明屬透射照明一、顯微鏡的種類及原理一、顯微鏡的種類及原理2.2.明明視野顯微鏡視野顯微鏡一、顯微鏡的種類及原理一、顯微鏡的種類及原理3. 3. 相差顯微鏡相差顯微鏡形成亮背景暗物象的結(jié)果形成亮背景暗物象的