最全的高效液相知識(shí)

1、最全的高效液相知識(shí) 2011-09-24 15:06 | （分類:專業(yè) ） 高效液相色譜知識(shí)收藏Agilent1100 高壓液相色譜儀基本操作步驟 Agilent1100 液相基本操作步驟Agilent1100 高壓液相色譜儀維護(hù)保養(yǎng)知識(shí)保養(yǎng)事項(xiàng)：高壓液相色譜 HPLC 常見(jiàn)故障及排除方法 液相色譜柱使用及保養(yǎng) 高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 （一） 高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 （七） 高效液相色譜儀中反相 HPLC 柱子的清潔和再生 HPLC 對(duì)流動(dòng)相的基本要求 高效液相色譜Waters 600E-2487 HPLC系統(tǒng)SOPWaters高效液相色譜系統(tǒng)操作規(guī)程高效液相色譜儀 （Ag

2、ilent 1100） 操作注意事項(xiàng)色譜掃盲班Agilent1100 高壓液相色譜儀基本操作步驟 Agilent1100 液相基本操作步驟（一）、開(kāi)機(jī)：1、打開(kāi)計(jì)算機(jī) ,進(jìn)入 Windows NT （或 Windows 2000）畫(huà)面 ,并運(yùn)行 Bootp Server 程序。2、打開(kāi) 1100 LC 各模塊電源。3、 待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online 圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動(dòng)與 1100LC 通 訊，進(jìn)入的工作站畫(huà)面。4、 從“ View菜單中選擇 “ Methodand Run control畫(huà)面，單擊” View菜單中的 “ ShowTop Toolbar，“

3、“ Show status toolbar， “ System diagram ” , ” Sampling diag使其命令前有 "v標(biāo) 志，來(lái)調(diào)用所需的界面。5 、把流動(dòng)相放入溶劑瓶中。6、打開(kāi)Purge閥。7、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入泵編輯畫(huà)面。8 、設(shè) Flow：5ml/min ，單擊 OK。9、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊 Pump control選項(xiàng)，選中On,單擊OK, 則系統(tǒng)開(kāi)始Purge,直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無(wú)氣泡為止，切換通道繼續(xù) Purge,直 到所有要用通道無(wú)氣泡為止。10、 單擊Pump

4、圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項(xiàng)，選中Off,單擊Ok 關(guān)泵,關(guān)閉 Purge valve。11、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入Pump編輯畫(huà)面， 設(shè) Flow：1.0ml/min 。12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo),輸入溶劑的實(shí)際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯：1、開(kāi)始編輯完整方法：從“ Method菜單中選擇 “ Edit entire method項(xiàng)，如上圖所示選中除“ Datanalysis外的三項(xiàng)，單擊 Ok，進(jìn)入下一畫(huà)面。2、方法信息：在 “ Method Comments中加入方法的信息

5、（如：方法的用途等） 。單擊 Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。3、泵參數(shù)設(shè)定： (以二元泵為例)在 “ Flow處輸入流量,如 1ml/min，在 “ SolventB” 處輸入 70.0,(A=100-B),也可 Insert 一 行” Timetable "編輯梯度。在 “Pressure Limits Max處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。單擊 Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。4、自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)設(shè)定 :選擇合適的進(jìn)樣方式，進(jìn)樣體積1.0ul，洗瓶位置為6號(hào)?！?Standardnjection -”只能輸 入進(jìn)樣體積，此方式無(wú)洗針功能。 “Injection with Needle Wash ”可

6、以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會(huì)在洗瓶中洗針。“Use injector program -”可以點(diǎn)擊Edit 鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。點(diǎn)擊 Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定 :在” Temperature下面的方框內(nèi)輸入所需溫度，并選中它，點(diǎn)擊” more>>"鍵，如圖所示,選中” Same as left-'使柱溫箱的溫度左右一致。點(diǎn)擊 ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。6、VWD 檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定 :在” Wavelength下'方的空白處輸入所需的檢測(cè)波長(zhǎng)，如254nm,在” Peakwidth (Response time)下方點(diǎn)擊下拉

7、式三角框 ，選擇合適的響應(yīng)時(shí)間，如>0.1min(2s)。在Timetable中可以"I nser一行，輸入隨時(shí)間切換的波長(zhǎng)，如1min ，波長(zhǎng)=300nm。點(diǎn)擊 ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。7、DAD 檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定 :檢測(cè)波長(zhǎng) : 254nm，BW=30nm， 參比波長(zhǎng) =350nm，BW=100nm;僉測(cè)波長(zhǎng)：一般選擇最大吸收處的波長(zhǎng)。樣品帶寬BW: 一般選擇最大吸收值一半處 的整個(gè)寬度。參比波長(zhǎng)：一般選擇在靠近樣品信號(hào)的無(wú)吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號(hào)的帶寬相等，許多情況下用 100nm 作為缺省值。 Peak width(Response time):其值盡

8、可能接近要測(cè)的窄峰峰寬。Slit 狹縫窄，光譜分辨率高；寬時(shí)，噪音低。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步長(zhǎng)，范圍，閾值。選中所用的燈。點(diǎn)擊 Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。8、RID 檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定 :色譜條件 :進(jìn)樣體積 : 20ul 。 光學(xué)單元溫度 : Off 。極性: 正。峰寬 (響應(yīng)時(shí)間 ) : 4s 。 “ Optical Unit Temperature-若環(huán)境溫度控制在 戈C ,設(shè)定為Off,若環(huán)境溫度不穩(wěn)定，則 設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5 度，以防樣品在池中沉淀。“Peak width -'-大多數(shù)分析設(shè)為4S,只有在高速分析下設(shè)為更短?！癆utomatic recycling

9、after analysis -在不'進(jìn)行分析時(shí)可以讓流動(dòng)相循環(huán)，節(jié)省流動(dòng)相，檢測(cè)器連續(xù)運(yùn)行，可隨時(shí)投入使用。點(diǎn)擊 RID圖標(biāo)，選擇 RID Control : Heater設(shè)為 On,若要循環(huán)流動(dòng)相，必須將 “ Recycling Valve設(shè)為"ON。手動(dòng)purge參比池，將其設(shè)為 On,并輸入Purge時(shí)間。9、FLD 檢測(cè)器參數(shù)設(shè)定 :色譜條件:樣品: P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為 1:10。 進(jìn)樣體積: 5ul。 柱溫箱：30 C。EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 響應(yīng)時(shí)間 =4s. 停止時(shí)間: 出峰完畢。 Excitation

10、 A:激發(fā)波長(zhǎng)：200-700nm,步長(zhǎng)為 1nm,或 Zero Order。 Emission:發(fā)射波長(zhǎng)：280-900nm,步長(zhǎng)為 1nm,或 Zero Order。 PMT: 大多數(shù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭 ,則減少 PMT 值。 “ Peak width :大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為 4s,只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Multi Ex ：多波長(zhǎng)及光譜（激發(fā)）。 Multi Em :多波長(zhǎng)及光譜（發(fā)射） 。 同時(shí)可以輸入范圍 Range、步長(zhǎng)step、采集光譜。10、在 “ Run time checklist 中選中"“ Data acquisition，單擊 O

11、k。11、單擊 “ Method菜單，選中 “ Save method as輸入一方法名，如 “ tes，單擊 Ok。12、從菜單 “ View中選中” Onlinesignal，選中Windows 1,然后單擊Change鈕將所要 繪圖的信號(hào)移到右邊的框中，點(diǎn)擊Ok.（如同時(shí)檢測(cè)二個(gè)信號(hào)，則重復(fù)12,選中Windows 2）。13、 從“ Runeontrol菜單中選擇“ Sample info選項(xiàng)，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“ Data file 中選擇 “ Manual或 “ Prefix。”區(qū)別：Manual-每次做樣之前必須給出新名字 ，否則儀器會(huì)將上次的數(shù)據(jù)覆蓋。Prefix

12、在Prefix 框中輸入前綴，在 Counter 框中輸入計(jì)數(shù)器的起始位， 儀器會(huì)自動(dòng)命名，如 vwd0001， vwd0002 。14、從 Instrument 菜單選擇 System on。15、 等儀器Ready,基線平穩(wěn)，從 Method菜單中選擇 “ Run method,進(jìn)樣。（三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯 :1、從“ View菜單中，單擊 “ Data analysis進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫(huà)面。2、 從“ File菜單選擇“ Load signal,選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。3、 做譜圖優(yōu)化，從"Graphics菜單中選擇 “Signal options選項(xiàng)”。從Ra

13、nges中選擇 Auto scale 及合適的顯示時(shí)間，單擊ok,或選擇” Use Ranges”調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。4、積分 :（1）、從"In tegration中選擇 “ Auto in tegrate如積分結(jié)果不理想，再?gòu)牟藛沃羞x擇 “Integration Events 選項(xiàng)，選擇合適的 Slope sensitivity ，Peak width，Area reject，Height reject。（2）、從"Integration菜單'中選擇"Integrate選項(xiàng)，則數(shù)據(jù)被積分。（3）、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)

14、，直到滿意為止。（4）、單擊左邊“v圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。5、打印報(bào)告 :（1）、從“ Report菜單中選擇 “ Specify report選項(xiàng)，"進(jìn)入如上畫(huà)面。（2）、單擊" Quantitative Results 框中 Calculate 右側(cè)的黑三角，選中 Percen（t 面積百分比）， 其它選項(xiàng)不變。（3）、單擊 Ok.（4）、從“ Report菜單中選擇“ Print report，則報(bào)告結(jié)果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機(jī)上，則單擊 Report底部的“Print鈕。（四）、關(guān)機(jī) :關(guān)機(jī)前，用 1 00%的水沖洗系統(tǒng) 2 0分鐘，然后用有機(jī)溶劑沖洗系

15、統(tǒng) 10分鐘（如 ACN）， 然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗 退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計(jì)算機(jī)（用 shut down 關(guān)）。關(guān)掉 Agilent 1100 電源開(kāi)關(guān)。Agilent1100 高壓液相色譜儀維護(hù)保養(yǎng)知識(shí)保養(yǎng)事項(xiàng)：1、色譜柱長(zhǎng)時(shí)間不用，存放時(shí)，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如ACN 適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機(jī)相）2、對(duì)于手動(dòng)進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時(shí)，要用水沖洗進(jìn)樣口，同時(shí)搬動(dòng)進(jìn)樣閥數(shù)次，每次 數(shù)毫升。3、流動(dòng)相使用前必須過(guò)濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長(zhǎng)菌）。4、 帶seal-wash的1100,要配制90%水+10%異丙醇，以每分 2

16、3滴的速度虹吸排出，溶 劑不能干涸。5、其它主意事項(xiàng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，或由現(xiàn)場(chǎng)工程師介紹。維護(hù)知識(shí)問(wèn)答1 、為什么溶劑和樣品要過(guò)濾 ?溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，消除由于污染對(duì)分析結(jié) 果的影響。色譜柱： 由于填料顆粒很細(xì)， 色譜柱內(nèi)腔很小， 溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)使色譜柱和毛細(xì) 管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會(huì)增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì)增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過(guò)濾頭的類型：30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2 和0.45兩種規(guī)格,材料有纖維素，醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50113mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，由0.2

17、和0.45兩種規(guī)格，材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2 yni和0.45兩種規(guī)格。處理樣品體積為7卩1濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍 66 濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。2、為什么 HPLC 用緩沖鹽時(shí)要加在線 Seal-wash 選項(xiàng)？HPLC 用緩沖鹽時(shí) ，由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象，析出的細(xì)小鹽粒非常堅(jiān)硬它附著

18、在藍(lán)寶石活塞桿上 ，隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運(yùn)動(dòng)，容易產(chǎn)生劃痕 ，并磨損密封墊 ，造成漏液等故障現(xiàn)象。在線 Seal-wash 選項(xiàng)能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度 在 0.1mol 或大于 0.1mol 時(shí)，必須使用該在線沖洗選項(xiàng) .清洗液配制 : 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長(zhǎng)和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。3、為什么 Agilent 1100LC 的流動(dòng)相管路非常細(xì) ?在使用 HPLC 時(shí)，應(yīng)特別注意 ”柱外效應(yīng) ”對(duì)分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動(dòng)相 中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小 45個(gè)數(shù)量級(jí)， 液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢

19、1-2 個(gè)數(shù)量級(jí)。 因 此，樣品進(jìn)入色譜柱后， 在柱子以外的任何死體積 （進(jìn)樣器、 柱接頭、 連接管、 檢測(cè)器） 中， 樣品分子的擴(kuò)散和滯留，都會(huì)引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小， 獲得理想的分析結(jié)果， Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動(dòng)相管路。毛細(xì)管線分類： 0.17mm 內(nèi)徑 綠色 ;0.12mm 內(nèi)徑 紅色。PEEK 管線：內(nèi)徑 0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm 。毛細(xì)管線優(yōu)點(diǎn) : 柔韌性好 .*Agilent 公司同時(shí)備有 1/16in 的粗外徑毛細(xì)管線 ,適用于不同習(xí)慣的用戶,優(yōu)點(diǎn)是剛性好但柔韌性差一些。4、流動(dòng)

20、相使用前為什么要脫氣？流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如 O2 ），以防止在洗脫過(guò)程 中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)， 因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。 氣泡會(huì)增加基線的噪音， 造成 靈敏度下降， 甚至無(wú)法分析。 溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化， 柱中固定相發(fā)生 降解而改變柱的分離性能。若用 FLD ，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩 10-15min ，此

21、法效果最差。 在線真空脫氣法： Agilent1100LC 真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制， 無(wú)需額 外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長(zhǎng)會(huì)堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運(yùn)行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑過(guò)濾器的堵塞。A :請(qǐng)嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過(guò)濾。B :請(qǐng)勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C:如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉.D：在溶劑瓶?jī)?nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣，以隔絕空氣。E：避免使

22、溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過(guò)濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h,然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。6、Agilent 1100LC 泵如何維護(hù)？Agilent 1100LC 泵給色譜柱提供穩(wěn)定、 無(wú)脈動(dòng)、流量準(zhǔn)確的流動(dòng)相， 及時(shí)合理的維護(hù)非常 重要。A :流動(dòng)相使用前請(qǐng)必須脫氣、過(guò)濾。B :使用緩沖鹽時(shí)，要加在線 Seal-wash 選項(xiàng)。C:關(guān)機(jī)前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機(jī)溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱） 。 正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗D:及時(shí)更換 Purge V

23、alve內(nèi)的過(guò)濾芯。（當(dāng)打開(kāi)Purge Valve時(shí)，壓力高于10bar,表明過(guò)濾 芯已堵）。E:使用合適的密封圈。7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈， 特別是長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)， 需更換另一種不同的密封圈， 我們建議使用聚四氟 乙烯密封圈。 （p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0 200bar;建議在泵的壓力限制中，將最大壓力設(shè)為 200bar。8、使用梯度比例發(fā)時(shí)要注意那些事項(xiàng)？當(dāng)鹽溶液與有機(jī)溶劑溶液混合時(shí)，鹽溶液能與有機(jī)溶劑溶液完全混溶，而不會(huì)出現(xiàn)沉淀。但是在比例

24、閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來(lái)，通常，閥 A 接水相 / 鹽溶液， D 接有 機(jī)溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。若顛倒過(guò)來(lái)，鹽可能落在有機(jī)溶 劑中，出現(xiàn)問(wèn)題。強(qiáng)烈建議：當(dāng)使用緩沖鹽溶液和有機(jī)溶劑時(shí)，推薦將緩沖鹽通道接在 A 通道上，有機(jī)溶 劑通道直接接在 A 通道的上方 D 通道上；定期用水沖洗所有的通道，以除去閥口上可能出 現(xiàn)的鹽沉淀。9、在線真空脫氣機(jī)使用要注意那些事項(xiàng)？一般來(lái)說(shuō)， Agilent 1100LC 的真空脫氣機(jī)無(wú)需過(guò)多維護(hù)，只需注意幾個(gè)注意事項(xiàng)就可以 了。A :第一次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿脫氣機(jī)腔體；更換不同類型的溶劑時(shí)，要先 抽空，再抽滿。

25、B :不用的通道要充滿溶劑或密閉起來(lái)。10、更換色譜柱時(shí)要注意什么事項(xiàng) ?在使用 HPLC 時(shí),應(yīng)特別注意 ”柱外效應(yīng) ”對(duì)分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動(dòng)相 中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小 45個(gè)數(shù)量級(jí)， 液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢 1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。 因 此，樣品進(jìn)入色譜柱后， 在柱子以外的任何死體積 （進(jìn)樣器、 柱接頭、連接管、檢測(cè)器） 中， 樣品分子的擴(kuò)散和滯留，都會(huì)引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小， 獲得理想的分析結(jié)果，儀器的流動(dòng)相管路連接非常重要 ,一般 Agilent 1100LC 在第一次安裝 時(shí),均有受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的安裝工程師負(fù)責(zé)安裝,各種接頭會(huì)處理的非常完美

26、?？蛻糁恍柙诟鼡Q色譜柱時(shí)注意接頭處理就可以了， 一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接頭， 柱子出口為不銹鋼 卡套接頭或 PEEK 管線手?jǐn)Q街頭， 當(dāng)完成第一次安張后， 不銹鋼卡套已固定死， 當(dāng)接不同的 柱子時(shí)，要注意柱子接頭處的形狀和長(zhǎng)度，否則會(huì)產(chǎn)生一個(gè)非常大的死體積。11、手動(dòng)進(jìn)樣閥需做那些維護(hù)，使用時(shí)要注意什么？對(duì)于手動(dòng)進(jìn)樣器，當(dāng)使用緩沖溶液后，或者進(jìn)濃度差異比較大的樣品時(shí)要用專用工具而 不是用帶針頭的注射器沖洗進(jìn)樣口，同時(shí)搬動(dòng)進(jìn)樣閥數(shù)次，每次數(shù)毫升。注意事項(xiàng):安裝時(shí)六通閥的 5， 6 出口要與注射器在同一水平線上，以防止虹吸現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致 進(jìn)樣量的重復(fù)性變異。進(jìn)樣量的多少要根據(jù)定量管的 LO

27、OP 體積決定。當(dāng)樣品量少時(shí):進(jìn)樣體積由注射器的進(jìn)樣體積決定，但最大進(jìn)樣體積要小于 1/2loop 體積。當(dāng)樣品量較多時(shí):進(jìn)樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品完全把定量管的流動(dòng)相置 換干凈，需注射 56 倍的 LOOP 體積。要使用專用的液相注射器進(jìn)樣，絕對(duì)不可以用氣相的注射器。高壓液相色譜 HPLC 常見(jiàn)故障及排除方法診狀（一）保留時(shí)間變化 可能的原因 : 解 決 方 法1. 柱溫變化 : 柱恒溫2. 等度與梯度間未能充分平衡: 至少用 10 倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱3. 緩沖液容量不夠 : 用 >25mmol/L 的緩沖液4. 柱污染 : 每天沖洗柱5. 柱內(nèi)條件變化 : 穩(wěn)定進(jìn)樣條

28、件 ,調(diào)節(jié)流動(dòng)相6. 柱快達(dá)到壽命 : 采用保護(hù)柱（二）保留時(shí)間縮短 可能的原因 : 解 決 方 法1. 流速增加 : 檢查泵 ,重新設(shè)定流速2. 樣品超載 : 降低樣品量3. 鍵合相流失 : 流動(dòng)相 PH 值保持在 37.5 檢查柱的方向4. 流動(dòng)相組成變化: 防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5. 溫度增加 : 柱恒溫（三）保留時(shí)間延長(zhǎng)可能的原因 : 解 決 方 法1. 流速下降 : 管路泄漏 ,更換泵密封圈 ,排除泵內(nèi)氣泡2. 硅膠柱上活性點(diǎn)變化: 用流動(dòng)相改性劑 ,如加三乙胺 ,或采用堿至鈍化柱3. 鍵合相流失 : 同前 （二 ）34. 流動(dòng)相組成變化: 同前 （二）45. 溫度降低 : 同前 （二

29、 ）5（四）出現(xiàn)肩峰或分叉 可能的原因 : 解 決 方 法1. 樣品體積過(guò)大 : 用流動(dòng)相配樣 ,總的樣品體積小于第一峰的15%2. 樣品溶劑過(guò)強(qiáng) : 采用較弱的樣品溶劑3. 柱塌陷或形成短路通道: 更換色譜柱 ,采用較弱腐蝕性條件4. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效: 更換燒結(jié)不銹鋼 ,加在線過(guò)濾器 ,過(guò)濾樣品5. 進(jìn)樣器損壞 : 更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子（五）鬼峰可能的原因 : 解 決 方 法1. 進(jìn)樣閥殘余峰 : 每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥 ,改進(jìn)閥和樣品的清洗2. 樣品中未知物 : 處理樣品3. 柱未平衡 : 重新平衡柱 ,用流動(dòng)相作樣品溶劑（尤其是離子對(duì)色譜 ）4三氟乙酸（TFA）氧化（肽譜）：每天新配，用抗

30、氧化劑5. 水污染 （反相） : 通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用 HPLC 級(jí)的水（六）基線噪聲可能的原因 ： 解 決 方 法1. 氣泡 （尖銳峰 ） ： 流動(dòng)相脫氣 ，加柱后背壓2. 污染 （隨機(jī)噪聲 ） ： 清洗柱 ，凈化樣品 ，用 HPLC 級(jí)試劑3. 檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲： 更換氘燈4. 電干擾 （偶然噪聲 ） ： 采用穩(wěn)壓電源 ，檢查干擾的來(lái)源 （如水浴等 ）5. 檢測(cè)器中有氣泡： 流動(dòng)相脫氣 ，加柱后背壓（七）峰拖尾可能的原因 ： 解 決 方 法1. 柱超載 ： 降低樣品量 ，增加柱直徑采用較高容量的固定相2. 峰干擾 ： 清潔樣品 ，調(diào)整流動(dòng)相3. 硅羥基作用 加三乙胺 ，用堿致鈍化

31、柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH 值，鈍化樣品4. 同前 （四）4 ： 同前（四）45. 同前 （四）3 5. ： 同前 （四）36. 死體積或柱外體積過(guò)大： 連接點(diǎn)降至最低 ，對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整 ，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7. 柱效下降 : 用較低腐蝕條件 ,更換柱 ,采用保護(hù)柱（八）峰展寬可能的原因 : 解 決 方 法1. 進(jìn)樣體積過(guò)大 : 同 （四）12. 在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展 : 進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3. 數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 : 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于 10 點(diǎn)4. 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大 : 設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的 10%5. 流動(dòng)相粘度過(guò)高 : 增加柱溫 ,采用

32、低粘度流動(dòng)相6. 檢測(cè)池體積過(guò)大 : 用小體積池 ,卸下熱交換器7. 保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) : 等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫8. 柱外體積過(guò)大 : 將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至最小9. 樣品過(guò)載 : 進(jìn)小濃度小體積樣品 液相色譜柱使用及保養(yǎng)液相色譜儀由高壓液體泵、 檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成， 其中 液相色譜柱的正確安裝和使用， 是液相色譜工作的關(guān)鍵； 也是液相色譜工作者獲得正確可靠 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。一、液相色譜柱的安裝：1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為 7/16 英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺

33、紋（國(guó)內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英寸外螺紋與1 /4英寸柱管（6.35mm連 接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/ 16英寸（1.57mm的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用1.57mm連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺 釘擠壓變形后緊箍在連接管上 （連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在25mm 長(zhǎng)或其他固定尺寸 ）。在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或?yàn)V網(wǎng) ），用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為3 1 6#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的

34、溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性， 故使用時(shí)要注意， 柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑， 以避免腐蝕。b、柱填料：液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。正相柱：多以硅膠為柱填料。 根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種，其顆粒直徑在3 10 ym的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合CN， -NH2 等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)（ODS）的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在 3 10 yn之間。2，色譜柱的安裝：a、拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸

35、、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接（如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱 ）；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為 0.1-0.3mm 的不銹鋼管。 連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。 在接管時(shí)一定要設(shè)法 降低柱外死體積。 連接管通過(guò)空心螺釘、 壓環(huán)后盡量用力插到底， 然后順時(shí)針擰緊空心螺釘， 直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰14 圈，直至不漏液為止。二、液相色譜

36、柱的使用：色譜柱在使用前， 最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試， 并將結(jié)果保存起來(lái)， 作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化 的參考。但要注意： 柱性能可能由于所使用的樣品、 流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同； 另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（ 出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件 ），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。1、樣品的前處理：a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45 m勺過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。2、流動(dòng)相的配制：液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng) 相具備以下的特點(diǎn)：a、 流動(dòng)相對(duì)樣品

37、具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中 （或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱 中）。b、 流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低 柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命 （可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度 ）。d、 流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸 收較低的溶劑配制。e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)， 還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、流動(dòng)相流速的選擇：因

38、柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)， 使用不同的流速可得到不同的柱效。 對(duì)于一根特定 的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm 的色譜柱，流速一般選擇1ml /min，對(duì)于內(nèi)徑為 4.0mm柱，流速 0.8ml /min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)， 分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。 可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析 時(shí)間 （如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。a.由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的場(chǎng)合除外 ）。b 對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60 C的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水（電阻率大于 18 兆歐），

39、去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。c. 含水流動(dòng)相最奸在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好 加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。d .流動(dòng)相要求使用 0.45 濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱 性能。4、柱性能測(cè)試：?jiǎn)?dòng)液相色譜儀：a、流動(dòng)相流速設(shè)定為 1ml / min。b、 UV 檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為 254nm。 使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(一)I .概論一、液相色

40、譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stati on ary phase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸弓I、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同， 在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱為 經(jīng)典液相色譜法， 此方法柱效低

41、、 時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí)) 。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography , HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。 它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻， 小顆粒具有 高柱效，但會(huì)弓起高阻力， 需用高壓輸送流動(dòng)相， 故又稱高壓液相色譜法 (High Pressure Liquid Chromatography ， HPLC) 。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed LiquidChromatography， HSLP) 。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC 的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)

42、HPLC 有以下特點(diǎn)：高壓 -壓力可達(dá) 150300Kg/cm2 。色譜柱每米降壓為 75 Kg/cm2 以上。高速-流速為 0.110.0 ml/min 。高效-可達(dá) 5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá) 100種。高靈敏度-紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá) 0.01 ng。同時(shí)消耗樣品少。HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：速度快-通常分析一個(gè)樣品在 1530 min，有些樣品甚至在 5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高 -可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高-紫外檢測(cè)器可達(dá) 0.01 ng,熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá) 0.1pg。 柱子可反復(fù)使用 -用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣

43、品量少,容易回收 -樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC 應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC 同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動(dòng)相(常用CO2),因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(A

44、C)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC, 又稱分子篩、凝膠過(guò)濾 (GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法，此外還有電泳。按操 作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、 液液分配色譜法 (正相與反相) 、 離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。1.液固色譜法使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510 yim適用于分離分子量 2001000的組分，大多

45、數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原 理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。 分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò) 程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體 表面流失； 溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化； 另外在流動(dòng)相中存在的 固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。 由于涂布式固定相很難避免固定液流失， 現(xiàn)在已很少 采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的

46、極性不同可分為正相色譜法 （NPC）和反相色譜法（RPC）。 正相色譜法采用極性固定相 （如聚乙二醇、 氨基與腈基鍵合相 ）；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷） ，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留 時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等） 。反相色譜法一般用非極性固定相 （如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。 適用于分離非極性和極性較弱的化 合物。 RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè) HPLC 應(yīng)用的 80%左右。

47、隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或 易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH 值。但需要注意的是， C18 和 C8 使用的 pH 值通常為 2.57.5 （ 28），太高的 pH 值會(huì)使硅膠溶解， 太低的 pH 值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在 pH 1.510 范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動(dòng)相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3離子交換色譜法 固定相是離子交換樹(shù)

48、脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán) 上接上羧基、磺酸基（稱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）或季氨基（陰離子交換樹(shù)脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn) 行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分 離子與樹(shù)脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外， 它還受流動(dòng)相的 pH 值和離子強(qiáng)度影響。 pH 值可改變化合物的解離程度， 進(jìn)而影響其與固定相的作用。 流動(dòng)相的鹽濃度大， 則離子強(qiáng)度 高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主

49、要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。4離子對(duì)色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形 成中性的離子對(duì)化合物后， 在非極性固定相中溶解度增大， 從而使其分離效果改善。 主要用 于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高 氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對(duì)色譜法常用 ODS柱(即C18),流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L 的離子對(duì)試劑，在一定的 pH 值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測(cè)組分保時(shí)間與

50、離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流 動(dòng)相組成及其 pH 值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物 可以進(jìn)入孔中， 滯留時(shí)間長(zhǎng)；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動(dòng)相流出。它利用 分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物， 如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 (二) II 基本概念和理論 一、基本概念和術(shù)語(yǔ)1 色譜圖和峰參數(shù)色譜圖 (chromatogram)- 樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器，所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線，又稱色譜流出曲線 (elution profile) ?；€

51、 (base line)-經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測(cè)器測(cè)出一段時(shí)間的流出曲線。 一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音 (noise)-基線信號(hào)的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過(guò)載、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含 有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移 (drift)- 基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不 穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來(lái)也會(huì)產(chǎn)生漂移。色譜峰 (peak)-組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號(hào)產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正 常色譜峰近似于對(duì)稱形正態(tài)分布曲線(高斯 Gauss 曲線)。不對(duì)稱色譜峰有兩種：前延峰 (leading peak) 和拖尾

52、峰 (tailing peak) 。前者少見(jiàn)。拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對(duì)稱性。也稱為對(duì)稱因子(symmetry factor)或不對(duì)稱因子(asymmetry factor)。中國(guó)藥典規(guī)定 T應(yīng)為0.951.05。T v 0.95為前延峰，T > 1.05 為拖尾峰。峰底 -基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peak height, h)-峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰寬(peak width , W)-峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。W = 4半峰寬(peak width at half-height , Wh/2)-峰高一半處的峰寬

53、。Wh/2 = 2.355 <r標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,門正態(tài)分布曲線x =±時(shí)(拐點(diǎn))的峰寬之半。正常峰的拐 點(diǎn)在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說(shuō)明組分在流出色譜柱過(guò)程中的分散程度。b小，分散程度小、極點(diǎn)濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，b大，峰形胖、柱效低。峰面積(peak area, A)-峰與峰底所包圍的面積。2定性參數(shù)(保留值)死時(shí)間 (dead time, t0)-不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相(溶劑)通過(guò)色譜柱的時(shí)間。在反相 HPLC 中可用苯磺酸鈉來(lái)測(cè)定死時(shí)間。死體積 (dead volume, V0)- 由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未

54、被固定相所占據(jù)的空間。它包 括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動(dòng)相占據(jù)，Vm)、柱出口管路體積、 檢測(cè)器流動(dòng)池體積。 其中只有 Vm 參與色譜平衡過(guò)程, 其它 3 部分只起峰擴(kuò)展作 用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0 = FXt0 ( F為流速)保留時(shí)間 (retention time ，tR)-從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間。 保留體積 (retention volume ， VR)- 從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)流出溶劑的 體積。又稱洗脫體積。VR = F沱R調(diào)整保留時(shí)間 (adjusted retention time ，t

55、'R)- 扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。也稱折合保留時(shí)間 (reduced retention time) 。在實(shí)驗(yàn)條件(溫度、固定相等)一定時(shí)，t'R 只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R (或tR)可用于定性。t'R = tR 10調(diào)整保留體積 (adjusted retention volume ， V'R)- 扣除死體積后的保留體積。3柱效參數(shù)理論塔板數(shù) (theoretical plate number ， N)- 用于定量表示色譜柱的分離效率(簡(jiǎn)稱柱效)。N 取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等) 、填充狀況、柱長(zhǎng)、流動(dòng)相的種類和流 速及測(cè)定柱效

56、所用物質(zhì)的性質(zhì)。 在一張多組分色譜圖上， 如果各組分含量相當(dāng)， 則后洗脫的 峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計(jì)算理論塔數(shù)比用峰寬計(jì)算更為方便和常用，因?yàn)榘敕鍖捀诇?zhǔn)確測(cè)定， 尤其是對(duì)稍有拖尾的峰。N 與柱長(zhǎng)成正比，柱越長(zhǎng)， N 越大。用 N 表示柱效時(shí)應(yīng)注明柱長(zhǎng)，如果未注明，則表示柱 長(zhǎng)為 1 米時(shí)的理論塔板數(shù)。 (一般 HPLC 柱的 N 在 1000 以上。)若用調(diào)整保留時(shí)間(t'R)計(jì)算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。理論塔板高度 (theoretical plate height ， H)- 每單位柱長(zhǎng)的方差。實(shí)際應(yīng)用時(shí)往往用柱長(zhǎng)L 和理論塔板數(shù)計(jì)算。4相平衡參數(shù)分配系數(shù) (distribution coefficient ， K)- 在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時(shí)，在 固定相與流動(dòng)相中的濃度之比。分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的 色譜分離機(jī)制中， K 有不同的概念： 吸附色譜法為吸附系數(shù)， 離子交換色譜法為選擇性系數(shù) (或稱交換系數(shù) )，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來(lái)表示。在條件 (流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時(shí)