最全的高效液相知識

1、最全的高效液相知識 2011-09-24 15:06 | （分類:專業(yè) ） 高效液相色譜知識收藏Agilent1100 高壓液相色譜儀基本操作步驟 Agilent1100 液相基本操作步驟Agilent1100 高壓液相色譜儀維護保養(yǎng)知識保養(yǎng)事項：高壓液相色譜 HPLC 常見故障及排除方法 液相色譜柱使用及保養(yǎng) 高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 （一） 高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 （七） 高效液相色譜儀中反相 HPLC 柱子的清潔和再生 HPLC 對流動相的基本要求 高效液相色譜Waters 600E-2487 HPLC系統(tǒng)SOPWaters高效液相色譜系統(tǒng)操作規(guī)程高效液相色譜儀 （Ag

2、ilent 1100） 操作注意事項色譜掃盲班Agilent1100 高壓液相色譜儀基本操作步驟 Agilent1100 液相基本操作步驟（一）、開機：1、打開計算機 ,進入 Windows NT （或 Windows 2000）畫面 ,并運行 Bootp Server 程序。2、打開 1100 LC 各模塊電源。3、 待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online 圖標(biāo)，化學(xué)工作站自動與 1100LC 通 訊，進入的工作站畫面。4、 從“ View菜單中選擇 “ Methodand Run control畫面，單擊” View菜單中的 “ ShowTop Toolbar，“

3、“ Show status toolbar， “ System diagram ” , ” Sampling diag使其命令前有 "v標(biāo) 志，來調(diào)用所需的界面。5 、把流動相放入溶劑瓶中。6、打開Purge閥。7、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項，進入泵編輯畫面。8 、設(shè) Flow：5ml/min ，單擊 OK。9、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊 Pump control選項，選中On,單擊OK, 則系統(tǒng)開始Purge,直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止，切換通道繼續(xù) Purge,直 到所有要用通道無氣泡為止。10、 單擊Pump

4、圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Pump Control選項，選中Off,單擊Ok 關(guān)泵,關(guān)閉 Purge valve。11、 單擊Pump圖標(biāo)，出現(xiàn)參數(shù)設(shè)定菜單，單擊Setup pump選項，進入Pump編輯畫面， 設(shè) Flow：1.0ml/min 。12、單擊泵下面的瓶圖標(biāo),輸入溶劑的實際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。（二）數(shù)據(jù)采集方法編輯：1、開始編輯完整方法：從“ Method菜單中選擇 “ Edit entire method項，如上圖所示選中除“ Datanalysis外的三項，單擊 Ok，進入下一畫面。2、方法信息：在 “ Method Comments中加入方法的信息

5、（如：方法的用途等） 。單擊 Ok 進入下一畫面。3、泵參數(shù)設(shè)定： (以二元泵為例)在 “ Flow處輸入流量,如 1ml/min，在 “ SolventB” 處輸入 70.0,(A=100-B),也可 Insert 一 行” Timetable "編輯梯度。在 “Pressure Limits Max處輸入柱子的最大耐高壓，以保護柱子。單擊 Ok 進入下一畫面。4、自動進樣器參數(shù)設(shè)定 :選擇合適的進樣方式，進樣體積1.0ul，洗瓶位置為6號。“ Standardnjection -”只能輸 入進樣體積，此方式無洗針功能。 “Injection with Needle Wash ”可

6、以輸入進樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會在洗瓶中洗針?！癠se injector program -”可以點擊Edit 鍵進行進樣程序編輯。點擊 Ok 進入下一畫面。5、柱溫箱參數(shù)設(shè)定 :在” Temperature下面的方框內(nèi)輸入所需溫度，并選中它，點擊” more>>"鍵，如圖所示,選中” Same as left-'使柱溫箱的溫度左右一致。點擊 ok 進入下一畫面。6、VWD 檢測器參數(shù)設(shè)定 :在” Wavelength下'方的空白處輸入所需的檢測波長，如254nm,在” Peakwidth (Response time)下方點擊下拉

7、式三角框 ，選擇合適的響應(yīng)時間，如>0.1min(2s)。在Timetable中可以"I nser一行，輸入隨時間切換的波長，如1min ，波長=300nm。點擊 ok 進入下一畫面。7、DAD 檢測器參數(shù)設(shè)定 :檢測波長 : 254nm，BW=30nm， 參比波長 =350nm，BW=100nm;僉測波長：一般選擇最大吸收處的波長。樣品帶寬BW: 一般選擇最大吸收值一半處 的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用 100nm 作為缺省值。 Peak width(Response time):其值盡

8、可能接近要測的窄峰峰寬。Slit 狹縫窄，光譜分辨率高；寬時，噪音低。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選中所用的燈。點擊 Ok 進入下一畫面。8、RID 檢測器參數(shù)設(shè)定 :色譜條件 :進樣體積 : 20ul 。 光學(xué)單元溫度 : Off 。極性: 正。峰寬 (響應(yīng)時間 ) : 4s 。 “ Optical Unit Temperature-若環(huán)境溫度控制在 戈C ,設(shè)定為Off,若環(huán)境溫度不穩(wěn)定，則 設(shè)定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5 度，以防樣品在池中沉淀?！癙eak width -'-大多數(shù)分析設(shè)為4S,只有在高速分析下設(shè)為更短?！癆utomatic recycling

9、after analysis -在不'進行分析時可以讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相，檢測器連續(xù)運行，可隨時投入使用。點擊 RID圖標(biāo)，選擇 RID Control : Heater設(shè)為 On,若要循環(huán)流動相，必須將 “ Recycling Valve設(shè)為"ON。手動purge參比池，將其設(shè)為 On,并輸入Purge時間。9、FLD 檢測器參數(shù)設(shè)定 :色譜條件:樣品: P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為 1:10。 進樣體積: 5ul。 柱溫箱：30 C。EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 響應(yīng)時間 =4s. 停止時間: 出峰完畢。 Excitation

10、 A:激發(fā)波長：200-700nm,步長為 1nm,或 Zero Order。 Emission:發(fā)射波長：280-900nm,步長為 1nm,或 Zero Order。 PMT: 大多數(shù)應(yīng)用適當(dāng)?shù)脑O(shè)定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭 ,則減少 PMT 值。 “ Peak width :大多數(shù)應(yīng)用設(shè)為 4s,只有快速分析采用小的設(shè)定值。 Multi Ex ：多波長及光譜（激發(fā)）。 Multi Em :多波長及光譜（發(fā)射） 。 同時可以輸入范圍 Range、步長step、采集光譜。10、在 “ Run time checklist 中選中"“ Data acquisition，單擊 O

11、k。11、單擊 “ Method菜單，選中 “ Save method as輸入一方法名，如 “ tes，單擊 Ok。12、從菜單 “ View中選中” Onlinesignal，選中Windows 1,然后單擊Change鈕將所要 繪圖的信號移到右邊的框中，點擊Ok.（如同時檢測二個信號，則重復(fù)12,選中Windows 2）。13、 從“ Runeontrol菜單中選擇“ Sample info選項，如上圖所示，輸入操作者名稱，在“ Data file 中選擇 “ Manual或 “ Prefix?！眳^(qū)別：Manual-每次做樣之前必須給出新名字 ，否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋。Prefix

12、在Prefix 框中輸入前綴，在 Counter 框中輸入計數(shù)器的起始位， 儀器會自動命名，如 vwd0001， vwd0002 。14、從 Instrument 菜單選擇 System on。15、 等儀器Ready,基線平穩(wěn)，從 Method菜單中選擇 “ Run method,進樣。（三）、數(shù)據(jù)分析方法編輯 :1、從“ View菜單中，單擊 “ Data analysis進入數(shù)據(jù)分析畫面。2、 從“ File菜單選擇“ Load signal,選中您的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示。單擊Ok。3、 做譜圖優(yōu)化，從"Graphics菜單中選擇 “Signal options選項”。從Ra

13、nges中選擇 Auto scale 及合適的顯示時間，單擊ok,或選擇” Use Ranges”調(diào)整。反復(fù)進行，直到圖的比例合適為止。4、積分 :（1）、從"In tegration中選擇 “ Auto in tegrate如積分結(jié)果不理想，再從菜單中選擇 “Integration Events 選項，選擇合適的 Slope sensitivity ，Peak width，Area reject，Height reject。（2）、從"Integration菜單'中選擇"Integrate選項，則數(shù)據(jù)被積分。（3）、如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)

14、，直到滿意為止。（4）、單擊左邊“v圖標(biāo)，將積分參數(shù)存入方法。5、打印報告 :（1）、從“ Report菜單中選擇 “ Specify report選項，"進入如上畫面。（2）、單擊" Quantitative Results 框中 Calculate 右側(cè)的黑三角，選中 Percen（t 面積百分比）， 其它選項不變。（3）、單擊 Ok.（4）、從“ Report菜單中選擇“ Print report，則報告結(jié)果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上，則單擊 Report底部的“Print鈕。（四）、關(guān)機 :關(guān)機前，用 1 00%的水沖洗系統(tǒng) 2 0分鐘，然后用有機溶劑沖洗系

15、統(tǒng) 10分鐘（如 ACN）， 然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗 退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計算機（用 shut down 關(guān)）。關(guān)掉 Agilent 1100 電源開關(guān)。Agilent1100 高壓液相色譜儀維護保養(yǎng)知識保養(yǎng)事項：1、色譜柱長時間不用，存放時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死（如ACN 適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應(yīng)的有機相）2、對于手動進樣器，當(dāng)使用緩沖溶液時，要用水沖洗進樣口，同時搬動進樣閥數(shù)次，每次 數(shù)毫升。3、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。4、 帶seal-wash的1100,要配制90%水+10%異丙醇，以每分 2

16、3滴的速度虹吸排出，溶 劑不能干涸。5、其它主意事項見說明書，或由現(xiàn)場工程師介紹。維護知識問答1 、為什么溶劑和樣品要過濾 ?溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結(jié) 果的影響。色譜柱： 由于填料顆粒很細(xì)， 色譜柱內(nèi)腔很小， 溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì) 管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。樣品過濾頭的類型：30mm內(nèi)徑：適用于大進樣量的過濾，由0.2 和0.45兩種規(guī)格,材料有纖維素，醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50113mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2

17、和0.45兩種規(guī)格，材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進樣量的過濾，由0.2 yni和0.45兩種規(guī)格。處理樣品體積為7卩1濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍 66 濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。2、為什么 HPLC 用緩沖鹽時要加在線 Seal-wash 選項？HPLC 用緩沖鹽時 ，由于泵頭內(nèi)的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現(xiàn)象，析出的細(xì)小鹽粒非常堅硬它附著

18、在藍(lán)寶石活塞桿上 ，隨著藍(lán)寶石活塞桿的往復(fù)運動，容易產(chǎn)生劃痕 ，并磨損密封墊 ，造成漏液等故障現(xiàn)象。在線 Seal-wash 選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結(jié)晶。緩沖鹽的濃度 在 0.1mol 或大于 0.1mol 時，必須使用該在線沖洗選項 .清洗液配制 : 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類生長和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。3、為什么 Agilent 1100LC 的流動相管路非常細(xì) ?在使用 HPLC 時，應(yīng)特別注意 ”柱外效應(yīng) ”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相 中的擴散系數(shù)比在氣體中小 45個數(shù)量級， 液體流動相的流速也比氣相慢

19、1-2 個數(shù)量級。 因 此，樣品進入色譜柱后， 在柱子以外的任何死體積 （進樣器、 柱接頭、 連接管、 檢測器） 中， 樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小， 獲得理想的分析結(jié)果， Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細(xì)管線作為流動相管路。毛細(xì)管線分類： 0.17mm 內(nèi)徑 綠色 ;0.12mm 內(nèi)徑 紅色。PEEK 管線：內(nèi)徑 0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm 。毛細(xì)管線優(yōu)點 : 柔韌性好 .*Agilent 公司同時備有 1/16in 的粗外徑毛細(xì)管線 ,適用于不同習(xí)慣的用戶,優(yōu)點是剛性好但柔韌性差一些。4、流動

20、相使用前為什么要脫氣？流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如 O2 ），以防止在洗脫過程 中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時， 因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。 氣泡會增加基線的噪音， 造成 靈敏度下降， 甚至無法分析。 溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化， 柱中固定相發(fā)生 降解而改變柱的分離性能。若用 FLD ，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩 10-15min ，此

21、法效果最差。 在線真空脫氣法： Agilent1100LC 真空脫機利用膜滲透技術(shù)， 在線脫氣，智能控制， 無需額 外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。5、如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類的生長會堵塞溶劑過濾器，從而影響泵的運行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=47）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞。A :請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾。B :請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液C:如果應(yīng)用許可，可在溶劑中加入0.0001-0.001M的疊氮化鈉.D：在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣，以隔絕空氣。E：避免使

22、溶劑瓶暴露在直射陽光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。堵塞后的處理法方法：將過濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h,然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。6、Agilent 1100LC 泵如何維護？Agilent 1100LC 泵給色譜柱提供穩(wěn)定、 無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相， 及時合理的維護非常 重要。A :流動相使用前請必須脫氣、過濾。B :使用緩沖鹽時，要加在線 Seal-wash 選項。C:關(guān)機前，用 100%的水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱） 。 正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗D:及時更換 Purge V

23、alve內(nèi)的過濾芯。（當(dāng)打開Purge Valve時，壓力高于10bar,表明過濾 芯已堵）。E:使用合適的密封圈。7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？泵頭活塞的標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標(biāo)準(zhǔn)活塞密封圈， 特別是長時間使用時， 需更換另一種不同的密封圈， 我們建議使用聚四氟 乙烯密封圈。 （p/n0905-1420 2/pk）*注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0 200bar;建議在泵的壓力限制中，將最大壓力設(shè)為 200bar。8、使用梯度比例發(fā)時要注意那些事項？當(dāng)鹽溶液與有機溶劑溶液混合時，鹽溶液能與有機溶劑溶液完全混溶，而不會出現(xiàn)沉淀。但是在比例

24、閥的混合點，重力作用使鹽顆粒沉淀下來，通常，閥 A 接水相 / 鹽溶液， D 接有 機溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。若顛倒過來，鹽可能落在有機溶 劑中，出現(xiàn)問題。強烈建議：當(dāng)使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時，推薦將緩沖鹽通道接在 A 通道上，有機溶 劑通道直接接在 A 通道的上方 D 通道上；定期用水沖洗所有的通道，以除去閥口上可能出 現(xiàn)的鹽沉淀。9、在線真空脫氣機使用要注意那些事項？一般來說， Agilent 1100LC 的真空脫氣機無需過多維護，只需注意幾個注意事項就可以 了。A :第一次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿脫氣機腔體；更換不同類型的溶劑時，要先 抽空，再抽滿。

25、B :不用的通道要充滿溶劑或密閉起來。10、更換色譜柱時要注意什么事項 ?在使用 HPLC 時,應(yīng)特別注意 ”柱外效應(yīng) ”對分析結(jié)果的影響，由于樣品分子在液體流動相 中的擴散系數(shù)比在氣體中小 45個數(shù)量級， 液體流動相的流速也比氣相慢 1-2個數(shù)量級。 因 此，樣品進入色譜柱后， 在柱子以外的任何死體積 （進樣器、 柱接頭、連接管、檢測器） 中， 樣品分子的擴散和滯留，都會引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應(yīng)減之最小， 獲得理想的分析結(jié)果，儀器的流動相管路連接非常重要 ,一般 Agilent 1100LC 在第一次安裝 時,均有受過專業(yè)培訓(xùn)的安裝工程師負(fù)責(zé)安裝,各種接頭會處理的非常完美

26、?？蛻糁恍柙诟鼡Q色譜柱時注意接頭處理就可以了， 一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接頭， 柱子出口為不銹鋼 卡套接頭或 PEEK 管線手?jǐn)Q街頭， 當(dāng)完成第一次安張后， 不銹鋼卡套已固定死， 當(dāng)接不同的 柱子時，要注意柱子接頭處的形狀和長度，否則會產(chǎn)生一個非常大的死體積。11、手動進樣閥需做那些維護，使用時要注意什么？對于手動進樣器，當(dāng)使用緩沖溶液后，或者進濃度差異比較大的樣品時要用專用工具而 不是用帶針頭的注射器沖洗進樣口，同時搬動進樣閥數(shù)次，每次數(shù)毫升。注意事項:安裝時六通閥的 5， 6 出口要與注射器在同一水平線上，以防止虹吸現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致 進樣量的重復(fù)性變異。進樣量的多少要根據(jù)定量管的 LO

27、OP 體積決定。當(dāng)樣品量少時:進樣體積由注射器的進樣體積決定，但最大進樣體積要小于 1/2loop 體積。當(dāng)樣品量較多時:進樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品完全把定量管的流動相置 換干凈，需注射 56 倍的 LOOP 體積。要使用專用的液相注射器進樣，絕對不可以用氣相的注射器。高壓液相色譜 HPLC 常見故障及排除方法診狀（一）保留時間變化 可能的原因 : 解 決 方 法1. 柱溫變化 : 柱恒溫2. 等度與梯度間未能充分平衡: 至少用 10 倍柱體積的流動相平衡柱3. 緩沖液容量不夠 : 用 >25mmol/L 的緩沖液4. 柱污染 : 每天沖洗柱5. 柱內(nèi)條件變化 : 穩(wěn)定進樣條

28、件 ,調(diào)節(jié)流動相6. 柱快達(dá)到壽命 : 采用保護柱（二）保留時間縮短 可能的原因 : 解 決 方 法1. 流速增加 : 檢查泵 ,重新設(shè)定流速2. 樣品超載 : 降低樣品量3. 鍵合相流失 : 流動相 PH 值保持在 37.5 檢查柱的方向4. 流動相組成變化: 防止流動相蒸發(fā)或沉淀5. 溫度增加 : 柱恒溫（三）保留時間延長可能的原因 : 解 決 方 法1. 流速下降 : 管路泄漏 ,更換泵密封圈 ,排除泵內(nèi)氣泡2. 硅膠柱上活性點變化: 用流動相改性劑 ,如加三乙胺 ,或采用堿至鈍化柱3. 鍵合相流失 : 同前 （二 ）34. 流動相組成變化: 同前 （二）45. 溫度降低 : 同前 （二

29、 ）5（四）出現(xiàn)肩峰或分叉 可能的原因 : 解 決 方 法1. 樣品體積過大 : 用流動相配樣 ,總的樣品體積小于第一峰的15%2. 樣品溶劑過強 : 采用較弱的樣品溶劑3. 柱塌陷或形成短路通道: 更換色譜柱 ,采用較弱腐蝕性條件4. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效: 更換燒結(jié)不銹鋼 ,加在線過濾器 ,過濾樣品5. 進樣器損壞 : 更換進樣器轉(zhuǎn)子（五）鬼峰可能的原因 : 解 決 方 法1. 進樣閥殘余峰 : 每次用后用強溶劑清洗閥 ,改進閥和樣品的清洗2. 樣品中未知物 : 處理樣品3. 柱未平衡 : 重新平衡柱 ,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜 ）4三氟乙酸（TFA）氧化（肽譜）：每天新配，用抗

30、氧化劑5. 水污染 （反相） : 通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用 HPLC 級的水（六）基線噪聲可能的原因 ： 解 決 方 法1. 氣泡 （尖銳峰 ） ： 流動相脫氣 ，加柱后背壓2. 污染 （隨機噪聲 ） ： 清洗柱 ，凈化樣品 ，用 HPLC 級試劑3. 檢測器燈連續(xù)噪聲： 更換氘燈4. 電干擾 （偶然噪聲 ） ： 采用穩(wěn)壓電源 ，檢查干擾的來源 （如水浴等 ）5. 檢測器中有氣泡： 流動相脫氣 ，加柱后背壓（七）峰拖尾可能的原因 ： 解 決 方 法1. 柱超載 ： 降低樣品量 ，增加柱直徑采用較高容量的固定相2. 峰干擾 ： 清潔樣品 ，調(diào)整流動相3. 硅羥基作用 加三乙胺 ，用堿致鈍化

31、柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH 值，鈍化樣品4. 同前 （四）4 ： 同前（四）45. 同前 （四）3 5. ： 同前 （四）36. 死體積或柱外體積過大： 連接點降至最低 ，對所有連接點作合適調(diào)整 ，盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7. 柱效下降 : 用較低腐蝕條件 ,更換柱 ,采用保護柱（八）峰展寬可能的原因 : 解 決 方 法1. 進樣體積過大 : 同 （四）12. 在進樣閥中造成峰擴展 : 進樣前后排出氣泡以降低擴散3. 數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 : 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于 10 點4. 檢測器時間常數(shù)過大 : 設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的 10%5. 流動相粘度過高 : 增加柱溫 ,采用

32、低粘度流動相6. 檢測池體積過大 : 用小體積池 ,卸下熱交換器7. 保留時間過長 : 等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫8. 柱外體積過大 : 將連接管徑和連接管長度降至最小9. 樣品過載 : 進小濃度小體積樣品 液相色譜柱使用及保養(yǎng)液相色譜儀由高壓液體泵、 檢測器及液相色譜柱等三部分組成， 其中 液相色譜柱的正確安裝和使用， 是液相色譜工作的關(guān)鍵； 也是液相色譜工作者獲得正確可靠 的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。一、液相色譜柱的安裝：1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)：a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。 柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為 7/16 英寸外螺紋，另一端是3/16英寸的內(nèi)螺

33、紋（國內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英寸外螺紋與1 /4英寸柱管（6.35mm連 接，中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/ 16英寸（1.57mm的連接管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺 釘擠壓變形后緊箍在連接管上 （連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在25mm 長或其他固定尺寸 ）。在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網(wǎng) ），用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為3 1 6#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的

34、溶劑對其有一定的腐蝕性， 故使用時要注意， 柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑， 以避免腐蝕。b、柱填料：液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。正相柱：多以硅膠為柱填料。 根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3 10 ym的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合CN， -NH2 等官能團即所謂的鍵合相硅膠。反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在 3 10 yn之間。2，色譜柱的安裝：a、拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸

35、、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。c、 按柱管上標(biāo)示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接（如條件允許，建議在柱前使用保護柱 ）；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為 0.1-0.3mm 的不銹鋼管。 連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。 在接管時一定要設(shè)法 降低柱外死體積。 連接管通過空心螺釘、 壓環(huán)后盡量用力插到底， 然后順時針擰緊空心螺釘， 直到擰不動為止，再用扳手繼續(xù)順時針擰1/4-1/2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰14 圈，直至不漏液為止。二、液相色譜

36、柱的使用：色譜柱在使用前， 最好進行柱的性能測試， 并將結(jié)果保存起來， 作為今后評價柱性能變化 的參考。但要注意： 柱性能可能由于所使用的樣品、 流動相、柱溫等條件的差異而有所不同； 另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（ 出廠測試所使用的條件是最佳條件 ），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。1、樣品的前處理：a、最好使用流動相溶解樣品。b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45 m勺過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。2、流動相的配制：液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動 相具備以下的特點：a、 流動相對樣品

37、具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中 （或長時間保留在柱 中）。b、 流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)（特殊情況除外）。c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低 柱壓降，延長液體泵的使用壽命 （可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度 ）。d、 流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸 收較低的溶劑配制。e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測， 還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。3、流動相流速的選擇：因

38、柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)， 使用不同的流速可得到不同的柱效。 對于一根特定 的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm 的色譜柱，流速一般選擇1ml /min，對于內(nèi)徑為 4.0mm柱，流速 0.8ml /min為佳。當(dāng)選用最佳流速時， 分析時間可能延長。 可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析 時間 （如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。a.由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的場合除外 ）。b 對于正相柱推薦使用沸程為30-60 C的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水（電阻率大于 18 兆歐），

39、去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。c. 含水流動相最奸在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好 加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。d .流動相要求使用 0.45 濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。e.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱 性能。4、柱性能測試：啟動液相色譜儀：a、流動相流速設(shè)定為 1ml / min。b、 UV 檢測器波長設(shè)定為 254nm。 使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。記錄并計算測試結(jié)果。*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。高壓液相色譜HPLC培訓(xùn)教程(一)I .概論一、液相色

40、譜理論發(fā)展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stati on ary phase)發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸弓I、排阻、親和)的大小、強弱不同， 在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特(Tswett)在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為 經(jīng)典液相色譜法， 此方法柱效低

41、、 時間長(常有幾個小時) 。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography , HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。 它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻， 小顆粒具有 高柱效，但會弓起高阻力， 需用高壓輸送流動相， 故又稱高壓液相色譜法 (High Pressure Liquid Chromatography ， HPLC) 。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed LiquidChromatography， HSLP) 。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC 的特點和優(yōu)點

42、HPLC 有以下特點：高壓 -壓力可達(dá) 150300Kg/cm2 。色譜柱每米降壓為 75 Kg/cm2 以上。高速-流速為 0.110.0 ml/min 。高效-可達(dá) 5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達(dá) 100種。高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達(dá) 0.01 ng。同時消耗樣品少。HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快-通常分析一個樣品在 1530 min，有些樣品甚至在 5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高 -可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高-紫外檢測器可達(dá) 0.01 ng,熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá) 0.1pg。 柱子可反復(fù)使用 -用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣

43、品量少,容易回收 -樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC 應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。LC 同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體(界于氣體和液體之間的一種物相)為流動相(常用CO2),因其擴散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(A

44、C)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC, 又稱分子篩、凝膠過濾 (GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法，此外還有電泳。按操 作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、 液液分配色譜法 (正相與反相) 、 離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1.液固色譜法使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度510 yim適用于分離分子量 2001000的組分，大多

45、數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2液液色譜法使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原 理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。 分離過程是一個分配平衡過 程。涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體 表面流失； 溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化； 另外在流動相中存在的 固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。 由于涂布式固定相很難避免固定液流失， 現(xiàn)在已很少 采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的

46、極性不同可分為正相色譜法 （NPC）和反相色譜法（RPC）。 正相色譜法采用極性固定相 （如聚乙二醇、 氨基與腈基鍵合相 ）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷） ，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留 時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等） 。反相色譜法一般用非極性固定相 （如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。 適用于分離非極性和極性較弱的化 合物。 RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個 HPLC 應(yīng)用的 80%左右。

47、隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機樣品或 易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH 值。但需要注意的是， C18 和 C8 使用的 pH 值通常為 2.57.5 （ 28），太高的 pH 值會使硅膠溶解， 太低的 pH 值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在 pH 1.510 范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3離子交換色譜法 固定相是離子交換樹

48、脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán) 上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進 行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分 離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關(guān)外， 它還受流動相的 pH 值和離子強度影響。 pH 值可改變化合物的解離程度， 進而影響其與固定相的作用。 流動相的鹽濃度大， 則離子強度 高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主

49、要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。4離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形 成中性的離子對化合物后， 在非極性固定相中溶解度增大， 從而使其分離效果改善。 主要用 于分析離子強度大的酸堿物質(zhì)。分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高 氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。離子對色譜法常用 ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入310 mmol/L 的離子對試劑，在一定的 pH 值范圍內(nèi)進行分離。被測組分保時間與

50、離子對性質(zhì)、濃度、流 動相組成及其 pH 值、離子強度有關(guān)。5排阻色譜法固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物 可以進入孔中， 滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用 分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物， 如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 (二) II 基本概念和理論 一、基本概念和術(shù)語1 色譜圖和峰參數(shù)色譜圖 (chromatogram)- 樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線 (elution profile) ?；€

51、 (base line)-經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。 一般應(yīng)平行于時間軸。噪音 (noise)-基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含 有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移 (drift)- 基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不 穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。色譜峰 (peak)-組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正 常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線(高斯 Gauss 曲線)。不對稱色譜峰有兩種：前延峰 (leading peak) 和拖尾

52、峰 (tailing peak) 。前者少見。拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)。中國藥典規(guī)定 T應(yīng)為0.951.05。T v 0.95為前延峰，T > 1.05 為拖尾峰。峰底 -基線上峰的起點至終點的距離。峰高(peak height, h)-峰的最高點至峰底的距離。峰寬(peak width , W)-峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W = 4半峰寬(peak width at half-height , Wh/2)-峰高一半處的峰寬

53、。Wh/2 = 2.355 <r標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,門正態(tài)分布曲線x =±時(拐點)的峰寬之半。正常峰的拐 點在峰高的0.607倍處。標(biāo)準(zhǔn)偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。b小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，b大，峰形胖、柱效低。峰面積(peak area, A)-峰與峰底所包圍的面積。2定性參數(shù)(保留值)死時間 (dead time, t0)-不保留組分的保留時間。即流動相(溶劑)通過色譜柱的時間。在反相 HPLC 中可用苯磺酸鈉來測定死時間。死體積 (dead volume, V0)- 由進樣器進樣口到檢測器流動池未

54、被固定相所占據(jù)的空間。它包 括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙(被流動相占據(jù)，Vm)、柱出口管路體積、 檢測器流動池體積。 其中只有 Vm 參與色譜平衡過程, 其它 3 部分只起峰擴展作 用。為防止峰擴展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0 = FXt0 ( F為流速)保留時間 (retention time ，tR)-從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。 保留體積 (retention volume ， VR)- 從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的 體積。又稱洗脫體積。VR = F沱R調(diào)整保留時間 (adjusted retention time ，t

55、'R)- 扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間 (reduced retention time) 。在實驗條件(溫度、固定相等)一定時，t'R 只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R (或tR)可用于定性。t'R = tR 10調(diào)整保留體積 (adjusted retention volume ， V'R)- 扣除死體積后的保留體積。3柱效參數(shù)理論塔板數(shù) (theoretical plate number ， N)- 用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效)。N 取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等) 、填充狀況、柱長、流動相的種類和流 速及測定柱效

56、所用物質(zhì)的性質(zhì)。 在一張多組分色譜圖上， 如果各組分含量相當(dāng)， 則后洗脫的 峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準(zhǔn)確測定， 尤其是對稍有拖尾的峰。N 與柱長成正比，柱越長， N 越大。用 N 表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱 長為 1 米時的理論塔板數(shù)。 (一般 HPLC 柱的 N 在 1000 以上。)若用調(diào)整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。理論塔板高度 (theoretical plate height ， H)- 每單位柱長的方差。實際應(yīng)用時往往用柱長L 和理論塔板數(shù)計算。4相平衡參數(shù)分配系數(shù) (distribution coefficient ， K)- 在一定溫度下，化合物在兩相間達(dá)到分配平衡時，在 固定相與流動相中的濃度之比。分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的 色譜分離機制中， K 有不同的概念： 吸附色譜法為吸附系數(shù)， 離子交換色譜法為選擇性系數(shù) (或稱交換系數(shù) )，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。在條件 (流動相、固定相、溫度和壓力等)一定，樣品濃度很低時