分子生物學(xué)新技術(shù)及應(yīng)用

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分子生物學(xué)新技術(shù)及其應(yīng)用溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第十章第十章Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展 什么是代謝組學(xué)？ 代謝組學(xué)研究方法 代謝組學(xué)分析技術(shù) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS） 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS） 核磁共振技術(shù)（NMR）Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics一、

2、代謝組學(xué)的概念 組學(xué)時代基因表達(dá)基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組代謝組學(xué)第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics代謝組學(xué)研究什么？生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）代謝產(chǎn)物發(fā)生變化（種類，隨時間變化）特定基因突變環(huán)境變化生物體系代謝組學(xué)研究對象第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics體內(nèi)各種物質(zhì)代謝過程互相聯(lián)系形成一個整體體內(nèi)各種物質(zhì)代謝過程互相聯(lián)系形成一個整體 糖類糖類 脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)水水 無機(jī)鹽無機(jī)鹽維生素維生素各種物質(zhì)代謝之間互有聯(lián)系，

3、相互依存。各種物質(zhì)代謝之間互有聯(lián)系，相互依存。 消化吸收消化吸收中間代謝中間代謝廢物排泄廢物排泄第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics機(jī)體物質(zhì)代謝不斷受到精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝不斷受到精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)體有精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)體有精細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)代謝的機(jī)制，調(diào)節(jié)代謝的強(qiáng)度、方向和速度強(qiáng)度、方向和速度內(nèi)外環(huán)境內(nèi)外環(huán)境的變化的變化對機(jī)體代謝造成對機(jī)體代謝造成影響影響適應(yīng)環(huán)境適應(yīng)環(huán)境的變化的變化精細(xì)的調(diào)節(jié)控制第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics普

4、遍定義 代謝組學(xué)：通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。 研究對象：相對分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子。 代謝物小分子類別：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂類、金屬離子。第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics特點(diǎn)1.關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物。2.對生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究3.內(nèi)源性小分子化合物的上調(diào)和小調(diào)指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子的影響。4.內(nèi)源性化合物的特點(diǎn)用來表征疾

5、病和藥物篩選。第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics研究方法 研究步驟：生物組織，體液經(jīng)滅活預(yù)處理多個方法聯(lián)用第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics應(yīng)用： 藥物研發(fā) 疾病研究 植物代謝組學(xué) 微生物代謝組學(xué) 中藥現(xiàn)代化第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics連接圖數(shù)據(jù)庫 Connections Map DB京都基因與基因組百科全書 KEGG (htt

6、p:/www.genome.jp/kegg/ligand.html)生物化學(xué)途徑 ExPASy互聯(lián)網(wǎng)主要代謝途徑 main metabolic pathways on Internert, MMPDuke 博士植物化學(xué)和民族植物學(xué)數(shù)據(jù)庫Arizona 大學(xué)天然數(shù)據(jù)庫Wiley_handbook of gc-ms新藥及其代謝產(chǎn)物質(zhì)譜庫http:/www.ualberta.ca/_gjones/mslib.htm“腫瘤”代謝組數(shù)據(jù)庫http:/www.metabolic-Pubmed 化合物數(shù)據(jù)庫NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫/srd

7、/nistl.htm一些有用的數(shù)據(jù)庫：第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics分析技術(shù)1.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 工作原理：氣相色譜儀接口質(zhì)譜儀常壓高真空離子源質(zhì)量分析器檢測器第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics幾種新的GC-MS技術(shù) 全二維氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)（GCGC-TOFMS） 全二維氣相色譜：氣化室檢測器色譜柱1色譜柱2調(diào)制器第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab

8、of Medical Genetics檸檬水中檸檬烯的手性化合物分析只能看到一個峰色譜圖_柱1 (檢測器: FID)色譜圖_柱2 (檢測器: MS)切換到第二根色譜柱第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics研究實(shí)例：用Leco ChromaTOF soft ware得到的質(zhì)荷比為73（m/z）的離子碎片典型GCGC-TOFMS二維血漿色譜圖（Analytica Chimica Acta，2009，633，257-262）第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Me

9、dical Genetics2.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 工作原理：液相色譜儀接口質(zhì)譜儀常壓高真空離子源質(zhì)量分析器檢測器第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的新技術(shù) 4000Q Trap LC/MS/MS 第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsYang Jun 等運(yùn)用安捷倫公司的高效液相色譜系統(tǒng)配合API公司的Q-TRAPLC液相質(zhì)譜系統(tǒng)。研究50個健康人和慢性乙肝病人的血清樣本，經(jīng)過脫蛋白處理。

10、經(jīng)過去噪音，峰型尖銳化等處理。使用PLS-DA處理代謝數(shù)據(jù)，研究確定了代謝物標(biāo)記分子。（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561）下圖為分析結(jié)果：使用PLS-DA處理代謝數(shù)據(jù)正常組和慢性乙肝組對照（Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561） 第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics新型液相色譜技術(shù)UPLC新型超高液相色譜儀第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展HPLC色譜柱填料顆粒：色譜柱填料顆粒：3、5mUPLC色譜柱

11、填料顆粒：色譜柱填料顆粒：1.7m分離能力得到空前提高分離能力得到空前提高Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 比較（a）HPLC和（b）UPLC用于美沙芬的代謝物TOP質(zhì)譜全掃描（Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843）第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical GeneticsUPLC在代謝組學(xué)中的研究優(yōu)勢： UPLC相對于傳統(tǒng)的HPLC有更好的分離效率、峰容量、及靈敏度，提供更適合與質(zhì)譜聯(lián)用的接口，有助于檢出更多的代謝物。 提

12、高方法通量、靈敏度，改善與質(zhì)譜聯(lián)用的定性定量結(jié)果。 UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用為代謝組學(xué)研究提供更加高效、靈敏的研究平臺。第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（CE-MS） 代謝組學(xué)研究的生物樣品中包含多種離子性代謝物（糖酵解代謝產(chǎn)物、三羧酸循環(huán)代謝物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、輔酶等代謝物。） 毛細(xì)管電泳以毛細(xì)管為分離通道、采用高壓直流電場為驅(qū)動力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實(shí)現(xiàn)分離。 適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分

13、離分析。 第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（蘭州理工大學(xué)）型號： P/ACE MDQ-Deca XP plus 廠家：美國 Beckan Coulter-FinniganZhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics核磁共振技術(shù)（NMR） 基本原理是：在排除雜質(zhì)及水峰的干擾下，1H-NMR的譜峰與樣品中的化合物的氫原子是一一對應(yīng)的。所測的樣品中的每一個氫在譜圖中都有唯一的譜峰與之相對應(yīng)。圖譜中信號的強(qiáng)弱則反映出樣品中各組分相對含量的關(guān)系，適用于研究代謝產(chǎn)物。 第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics第一節(jié) 代謝組學(xué)及其研究進(jìn)展北京大