蛋白樣本制備定量及western步驟詳解

1、會(huì)計(jì)學(xué)1蛋白樣本制備定量及蛋白樣本制備定量及western步驟詳解步驟詳解蛋白樣本蛋白樣本activity assaysprotein microarraysSDS-PAGE /IEFimmunoblottingmass spectrometryEMSAELISA蛋白樣本制備的目的蛋白樣本制備的目的: 后續(xù)應(yīng)用后續(xù)應(yīng)用蛋白樣本制備原則方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性方法應(yīng)具備標(biāo)準(zhǔn)化，具有重現(xiàn)性 、可靠性、簡(jiǎn)便性；、可靠性、簡(jiǎn)便性；盡量抽提完全；盡量抽提完全；應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)應(yīng)使所有蛋白全部處于溶解狀態(tài)防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止發(fā)生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止在抽提過程

2、中發(fā)生化學(xué)修飾防止在抽提過程中發(fā)生化學(xué)修飾如做如做2D則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白則需去除高豐度蛋白或無關(guān)蛋白必要時(shí)去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白必要時(shí)去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。制備蛋白的目的制備蛋白的目的活性分析 免疫印跡雜交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞 組織 固定組織或石蠟包埋組織 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白樣本等目的蛋白的結(jié)性質(zhì)目的蛋白的結(jié)性質(zhì)與分布與分布分布于胞槳/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四級(jí)結(jié)構(gòu)特征 磷酸化等修飾方法的選擇方法的選擇 1 自行配制抽提試劑,根據(jù)文獻(xiàn)方法或經(jīng)驗(yàn)提取 2 購(gòu)買商品化試

3、劑盒,按其說明書的方法提取裂解樣品離心收集定量檢測(cè)表面活性劑表面活性劑緩沖液緩沖液蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑磷酸酶抑制劑磷酸酶抑制劑其它：其它：H2O、NaCl、等、等還原劑還原劑RIPA Buffer緩沖液緩沖液Tris-HCl（pH7.5),提供提供pH環(huán)境，使蛋白保持穩(wěn)定，環(huán)境，使蛋白保持穩(wěn)定，增加溶解性增加溶解性。溶解膜與脂膜，溶解與穩(wěn)定蛋白質(zhì)（特別是膜蛋白）溶解膜與脂膜，溶解與穩(wěn)定蛋白質(zhì)（特別是膜蛋白）分為離子型（如分為離子型（如SDS、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（如如NP-40、Triton-100、tween系列等）。系列等）。 1 陰離子型陰離子型: S

4、DS 脫氧膽酸鹽 2 陽離子型陽離子型: CPB和CTAB 3 雙性離子型雙性離子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非離子型非離子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等參考文獻(xiàn)報(bào)告保持生物活性時(shí)使用的表面活性劑參考文獻(xiàn)報(bào)告保持生物活性時(shí)使用的表面活性劑選選用用表表面面活活性性劑劑考考慮慮的的因因素素工作條件下表面活性劑的溶解性工作條件下表面活性劑的溶解性使用分子生物學(xué)級(jí)的表面活性劑使用分子生物學(xué)級(jí)的表面活性劑,無核酸酶蛋白酶等無核酸酶蛋白酶等根據(jù)樣本下游的應(yīng)用來選擇表面活性劑的種類根據(jù)樣本下游的應(yīng)用來選擇表面活性劑的種類考慮表面活性

5、劑的去除方法考慮表面活性劑的去除方法表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量表面活性劑的純度影響提取蛋白的質(zhì)量保護(hù)蛋白活性時(shí)保護(hù)蛋白活性時(shí),不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度盡量使用毒性較低的表面活性劑盡量使用毒性較低的表面活性劑因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進(jìn)行分離因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進(jìn)行分離使用非表面活性劑使用非表面活性劑NDSB結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性結(jié)合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性有時(shí)比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析有時(shí)比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析,常先用一種表面活性劑將蛋白溶解常先用一種

6、表面活性劑將蛋白溶解,而另一種表面活性劑取代進(jìn)而另一種表面活性劑取代進(jìn)行蛋白的后續(xù)分析行蛋白的后續(xù)分析1疏水吸附方法疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法透析法 Dialysis3凝膠層析法凝膠層析法 Gel Chromatography4離子交換層析離子交換層析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性劑的疏水性根椐表面活性劑的疏水性,CMC,凝聚數(shù)目凝聚數(shù)目,和電荷等性質(zhì)來去除和電荷等性質(zhì)來去除. 蛋白蛋白酶抑酶抑制劑制劑抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨時(shí)加入時(shí)加入磷酸磷酸酶抑酶抑制

7、劑制劑抑制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使抑制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使用前臨時(shí)加入。用前臨時(shí)加入。試劑名稱試劑名稱抑制作用抑制作用氟化鈉氟化鈉酸性磷酸酶，絲氨酸酸性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶蘇氨酸磷酸酶正釩酸鈉正釩酸鈉堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸鈉焦磷酸鈉絲氨酸絲氨酸-蘇氨酸磷酸蘇氨酸磷酸 防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，保護(hù)二硫鍵。防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，保護(hù)二硫鍵。DTT、 巰基乙醇等。巰基乙醇等。.水；溶劑水；溶劑NaCl：可以適量加入甘可以適量加入甘油油,穩(wěn)定蛋白穩(wěn)定蛋白注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)可以適量加入可以適量加入Benzonase /DNase I

8、等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent的種的種類類 純度純度 濃度濃度 干干擾擾 去除等因素去除等因素Temperature 試劑和器皿冰上試劑和器皿冰上預(yù)冷預(yù)冷,低溫低溫4操操作作細(xì)胞或組織的樣細(xì)胞或組織的樣本量本量裂解液的用量裂解液的用量 按蛋白溶解度不同進(jìn)行分級(jí)抽提按蛋白溶解度不同進(jìn)行分級(jí)抽提,降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)第一步：用非表面活性劑溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第一步：用非表面活性劑溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：

9、把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白提取高疏水性蛋白(膜蛋白膜蛋白)；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（W/W）。）。v 用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白復(fù)雜性，而且可對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

10、但該法需質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。性。v 根椐胞漿根椐胞漿/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白的亞細(xì)胞策略用不同蛋白的亞細(xì)胞策略用不同提取液逐級(jí)溶解提取液逐級(jí)溶解v 首先用密度梯度離心方法分別分離首先用密度梯度離心方法分別分離出線粒體出線粒體,胞質(zhì)胞質(zhì),胞核胞核.v 再用線粒體抽提再用線粒體抽提Buffer溶解線粒體溶解線粒體蛋白蛋白. BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。）是理想的蛋白質(zhì)定量方法。該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對(duì)不同種類蛋白質(zhì)檢測(cè)的該方法因快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對(duì)不同種類蛋白質(zhì)檢測(cè)的變異系數(shù)非

11、常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為還原為Cu+，Cu+與與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，測(cè)定其在試劑形成紫色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。BCA法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，低濃度的去垢劑在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但

12、螯合劑（不影響檢測(cè)結(jié)果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一，巰基乙醇）和脂類會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值定影響。實(shí)驗(yàn)中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用較高，可試用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。法測(cè)定蛋白濃度。 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmax），由），由465nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)

13、為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏分鐘即可完成，其顏色可以在色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至分鐘至20分鐘之間，分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族顏色的穩(wěn)定性最好。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基

14、酸的含量不同，因此氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。去污劑、定時(shí)有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫、十二烷基硫酸鈉（酸鈉（SDS）干擾此法的測(cè)定。）干擾此法的測(cè)定。 Lowry法蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過去此法是法蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵應(yīng)用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深鎢酸鹽被蛋

15、白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺度與蛋白的量成正比。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。Diagram通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，蛋白質(zhì)的Western印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫

16、測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原理二抗孵育二抗孵育蛋白提取與定量蛋白提取與定量一一抗孵育抗孵育封閉封閉轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜SDS-聚丙烯酰胺電泳聚丙烯酰胺電泳蛋白變性蛋白變性顯影顯影蛋蛋白質(zhì)白質(zhì)-SDS膠束膠束加入Sample buffer沸水浴15min冰浴30min產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠加速劑加速劑催化劑催化劑單體單體交聯(lián)劑交聯(lián)劑四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）過硫酸胺或核黃素（過硫酸胺或核黃素（AP）甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（Bis） 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋

17、白樣品濃縮使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-ClPH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離使蛋白樣品分離PH8.8Tris-ClPH8.8Tris-Cl 高，根據(jù)蛋白高，根據(jù)蛋白大小大小電泳緩沖液：電泳緩沖液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系統(tǒng)系統(tǒng)。不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。灌制分離膠 隔絕空氣灌好后一般室溫放置灌好后一般室溫放置3040分鐘分鐘灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子分子量（分子量（kd）轉(zhuǎn)膜條件轉(zhuǎn)膜條件200同上，可在轉(zhuǎn)膜液中加同上，可在轉(zhuǎn)膜液

18、中加0.1SDS為避免膜與作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異為避免膜與作為檢測(cè)試劑的特異性第一抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理性背景提高，需對(duì)膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理,一般用一般用5的脫脂奶的脫脂奶粉或者粉或者3的的BSA室溫或室溫或37度封閉度封閉2小時(shí)。小時(shí)。ProteinProteinProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary

19、 AntibodyProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondary AntibodyProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP SubstrateSuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物SuperSignal West Femto超靈敏型底物SuperSignal West Femto增強(qiáng)型底物主

20、要優(yōu)點(diǎn)與ECL 系統(tǒng)相比減半的價(jià)格、雙倍的信號(hào)適用于HRP檢測(cè)的最靈敏的化學(xué)發(fā)光底物延長(zhǎng)的信號(hào)持續(xù)時(shí)間使這種底物用于今天的成像設(shè)備最為理想檢測(cè)下限10-12g10-15g 10-14g信號(hào)持續(xù)時(shí)間6-8小時(shí)8小時(shí)24小時(shí)首選檢測(cè)方法X膠片成像設(shè)備或X膠片成像設(shè)備或X膠片建議一抗稀釋度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建議二抗稀釋度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000產(chǎn)品保存期室溫1年41年或室溫6個(gè)月室溫1年建議印跡膜硝化纖維硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDFan

21、tibody AC-15 (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1 : HeLa nuclearLane 2 : HeLa whole cell lysateLane 3 : A431 cell lysateLane 4 : Jurkat cell lysateLane 5 : HEK293 cell lysate.v 一抗的選擇一抗的選擇: 1、 樣本的種屬樣本的種屬 2、 適用于適用于WB實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法 3、 單克隆抗體單克隆抗體 經(jīng)親和純化的多克隆抗體經(jīng)親和純化的多克隆抗體v 二抗的選擇二抗的選擇 與一抗種屬匹配與一抗種屬匹配 HRP標(biāo)記的標(biāo)記的 重鏈輕鏈 全長(zhǎng)的、全長(zhǎng)的、Fab段的以及段的以及Fc段的段的v 抗體的保存和使用：抗體的保存和使用： 1、按說明書的要求分裝保存；、按說明書的要求分裝保存； 避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍