甲狀腺癌中醫(yī)辨證唾液蛋白質(zhì)組診斷模型探究

1、甲狀腺癌中醫(yī)辨證唾液蛋白質(zhì)組診斷模型探究摘要：目的探討甲狀腺癌不同證型患者的唾液蛋白 表達(dá)質(zhì)譜的差異并構(gòu)建診斷模型，為甲狀腺癌的中醫(yī)辨證分 型提供客觀依據(jù)。方法應(yīng)用表面增強激光解析電離飛行時 間質(zhì)譜(seldi-tof-ms)技術(shù)分別檢測23例痰瘀互結(jié)型和 26例肝郁氣滯型甲狀腺癌患者的唾液蛋白質(zhì)指紋圖譜，篩選 出2組間特異性表達(dá)差異蛋白，并結(jié)合生物信息學(xué)方法建立 診斷模型。結(jié)果通過2組唾液蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)比較， 共獲得29個有明顯差異的蛋白峰(po. 05)o1. 2中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)3中的證型標(biāo)準(zhǔn)。 肝郁氣滯型：情志抑郁、胸悶不舒，心悸易汗，口干、便秘'； 頸部

2、腫物，質(zhì)堅硬，活動度范圍小或不隨吞咽上下移動，遇 郁怒腫塊增大；婦女可見乳房作脹疼痛，月經(jīng)不調(diào)；舌質(zhì)淡 紅，苔薄白或微黃，脈弦。痰瘀互結(jié)型：病程較長，胸悶 痰多、肢體倦怠、胃納不佳、頸部腫塊質(zhì)硬，表面不平，隨 吞咽上下移動受限或推之不動，或伴有淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，多伴 有疼痛；舌質(zhì)多紫黯或有斑點，舌苔多厚膩，脈象可見弦滑 或沉澀。1.3主要試劑與儀器pbsii-c型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀、np20芯片均為美國 ciphergen 公司產(chǎn)品。純水（hplc 級）、spa（sinapinic acid）、 乙氧、三氟乙酸均購自美國sigma公司。1.4研究方法1.4. 1唾液樣本的收集與處理晨起空腹時采集唾液

3、樣 本，收集到15 ml離心管中，4 °c下靜置1 h后，10 000 r/min. 4 °c下離心10 mino冰浴上分裝在1 ml ep管中，每管50 ?l, 于-80 °c冰箱保存。實驗時取出樣本，冰上解凍，所有檢測 唾液樣本均1次凍融，4 °c下離心5 min備用。1. 4. 2芯片的處理和樣品檢測 取唾液上清，每條芯片 的每個點直接上樣4?l,自然晾干后重復(fù)上樣1次，待干后 將芯片裝入96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架bio-processor中， 每孔加入10 ?l純水，置振蕩器上600 r/min、4 °c下振蕩 10 min,甩掉，拍干，

4、重復(fù)1次。將芯片從bio-processor 中取出，自然晾干后每點加半飽和spa溶液0.5 ?l,重復(fù)1 次，待干后即可上機檢測。1.4.3數(shù)據(jù)采集設(shè)置激光強度為220,靈敏度為9,收 集數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比范圍為2 00020 000 m/z,優(yōu)化范圍為2 00015 000 m/z,信號收集位置2080,平均每點收集20 次，收集總點數(shù)為140次。用ciphergen proteinchip software3. 2. 1軟件自動采集數(shù)據(jù)，縱坐標(biāo)為峰強度（蛋白 質(zhì)相對含量），橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比（m/z）。1. 5統(tǒng)計學(xué)方法所有原始數(shù)據(jù)先用proteinchip software3. 2. 1做

5、總離 子強度及分子量校正，使其達(dá)到均一。對位于2 00020 000 m/z峰值，用biomarker wizard軟件過濾噪音。設(shè)置初始的 噪音過濾值為5,二次信噪比為2,以10%為最小閾值進(jìn)行聚 類，經(jīng)上述數(shù)據(jù)預(yù)處理后，mann-whitney秩和檢驗比較2組 唾液蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（由biomarker wizard軟件完成），找 出2組之間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰。用biomaker pattern software5. 0. 2采用決策樹算法計算出多個變量（m/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰）變化對兩樣本的分類價值，確定最佳 的篩選模型，即診斷模型。2結(jié)果2.1唾液蛋白質(zhì)譜分析本研究所有唾液蛋白指

6、紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)聚類后共得到穩(wěn) 定表達(dá)的蛋白質(zhì)峰225個。m/z位于2 00020 000的波峰 有183個，其中有29個蛋白質(zhì)峰在2組之間表達(dá)量差異有 統(tǒng)計學(xué)意義（p 6王家祥，董瑞，劉秋亮，等.乳頭 狀甲狀腺癌患者血清中特異性標(biāo)志物的檢測與鑒定j.中 華腫瘤雜志,2009, 31 （4）： 265-268.7 劉煒，平飛云.表面加強激光解析電離-飛行時間- 質(zhì)譜技術(shù)及其在唾液檢測中的研究發(fā)展j. 口腔醫(yī)學(xué)， 2008, 28 （10）： 554-557.8 姜靜，王松靈唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展j.北京_9 ryu oh, atkinson jc, hoehn gt, et al. identif

7、ication of parotid salivary biomarkers in sjogren" s syndrome by surface-enhanced laser desorption/ionizationtimeof-flightmassspectrometry and two-dimensional difference gel electrophoresis j. rheuma.tology (oxford), 2006, 45(9) ： 1077-1086.10 wu zz, wang jg, zhang xl diagnostic model of saliva

8、 protein finger print analysis of patients with gastric cancerj world j gastroenterol, 2009, 15 (7)： 865-870.11 raymond sp, arnoud lf, jolan dg, et al. seldi-tof-ms of saliva methodology and pre-treatment effectsj. j chromatogr b analyt technol biomed life sci, 2007, 847 (1)： 45-53._12 raymond sp, arnoud lf, jolan dg, et al. salivary protei