乳鐵蛋白-聚合物泡囊載S14G-Humanin肽對Amyloid-β25-35誘導的阿爾茨海默病模型大鼠的神經(jīng)保護作用精品資料

1、乳鐵蛋白 -聚合物泡囊載 S14G-Humanin 肽對 Amyloid- 25-35 誘導的阿爾茨海默病模型大鼠的神經(jīng)保護作用俞媛 1，馮亮 2，高會樂 2，蔣新國 2* （ 1 第二軍醫(yī)大學藥學院藥劑學教研室上海200433，2 復旦大學藥學院藥劑學教研室上海200032）摘要：目的 構(gòu)建以乳鐵蛋白作為靶向功能基、可生物降解聚合物泡囊為載體的腦靶向遞藥系統(tǒng)，并對其腦部遞藥特性作出藥效學評價。方法制備載神經(jīng)肽S14G-Humanin 的乳鐵蛋白聚合物泡囊并對其進行表征，建立大鼠阿爾茨海默病模型，采用 Morris 水迷宮試驗評價載藥系統(tǒng)對大鼠記憶認知障礙的改善。結(jié)果 聚合物泡囊粒徑約126n

2、m，zeta 電位 -2.54mV，包封率 21.78%，藥效學實驗表明，載S14G-Humanin 的聚合物泡囊能夠顯著改善大鼠的記憶缺陷，同時對Amyloid- 25-35 誘導的 Bax 蛋白的過量表達具有抑制作用。結(jié)論乳鐵蛋白連接聚合物泡囊載藥系統(tǒng)能夠?qū)Χ嚯乃幬锲鸬奖Ｗo作用，提高藥物的治療效果，本遞藥系統(tǒng)具有較好的腦內(nèi)遞藥特性。關鍵詞：聚合物泡囊乳鐵蛋白阿爾茨海默病中圖分類號 :文獻標識碼 :文章編號 :Lactoferrin Conjugated self-assembled Polymer vesicles loaded S14G-Humanin, prevents Amyloid

3、- 25-35 induced memory impairment in ratsYU Yuan 1, FENG Liang 2, GAO Hui-le 2, JIANG Xin-guo 2* (1 Department of Pharmaceutics , School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433; 2 Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032)ABSTRACT: OB

4、JECTIVE To prepare a novel brain targeting system, lactoferrin conjugated self-assembledpolymer vesicles(Lf-PVs), which the brain delivery propertyhad been evaluated in vivo. METHODS S14G-Humanin (S14G-HN) as a neuroprotective peptide was entrapped within Lactoferrin conjugated self-assembledpolymer

5、 vesicles by an ammonium sulphate gradients method. The Lf-PVs were characterized for shape, size, electrical charge and entrapment efficiency. Thevivo effect of Lf-PVs contained S14G-HN was examined on amnesia induced by Amyloid- 25-35in rats. RESULTS The Lf-PVs had a round and vesicle-like shape w

6、ith a mean diameter around 126 nm by direct cryogenic temperature transmission electron micrograph (Cryo-TEM) and a negative electrical charge(-2.54mV). Coupling of Lf with PVs was confirmed by immuno-gold labeling of Lf visualized under the TEM. The drug entrapment efficiency is 21.78%. S14G-HN enc

7、apsulated into Lf-PVs could protect latent learning as well as spatial working memory and inhibit the over-expression of Bax protein in Amyloid- 25-35 treated rats. CONCLUSION The Lf-PVs may provide a promising carrier to deliver peptide across the BBB for the treatment of brain infection.KEY WORDS:

8、polymer vesicles; lactoferrin; Alzheimer's disease中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是危害人類健康的一大類疾病，而血腦屏障(blood-brainbarrieer,BBB)限制了大多數(shù)化學藥物、多肽藥物和基因藥物的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運，使藥物無法自主進入腦部。因此具有腦內(nèi)靶向遞藥作用的新型藥物傳遞系統(tǒng)得到廣泛研究，其中尤以通過受體介導轉(zhuǎn)運入腦的微粒遞藥系統(tǒng)的研究最為成功12,13 。乳鐵蛋白（ lactoferrin, Lf ）是一種多功能蛋白，主要用于調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境離子穩(wěn)定、抗微生物感染、調(diào)節(jié)細胞生長、增強免疫等，其生理功能通過乳鐵蛋白受體介導進入細胞來實現(xiàn) 9 ，有

9、研究表明腦部有乳鐵蛋白受體的表達。聚合物泡囊（Polymer Vesicles, PVs）是一種新型載藥系統(tǒng)，由具有兩親性質(zhì)、可生物降解的聚合物分子自組裝而成，結(jié)構(gòu)類似于細胞膜的雙分子層，體內(nèi)外的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于脂質(zhì)體 1 。PVs 形成條件溫和并且具有親水性內(nèi)核結(jié)構(gòu)，對蛋白多肽類藥物、基因藥物的載藥性能可望優(yōu)于其他一些納米微粒， 此外通過聚合物分子的種類、 分子量、嵌段比例選擇， 所構(gòu)建 PVs遞藥系統(tǒng)的理化特性乃至體內(nèi)行為更具有主觀的可調(diào)控性 1,2,4 。因此本研究以單甲氧基聚乙二醇乳酸羥基乙酸共聚物（ MPEG-PLGA ）和馬來酰亞胺基聚乙二醇乳酸羥基乙酸共聚物 （Maleimide-

10、PEG-PLGA ）5 制備 PVs 作為載藥系統(tǒng)， 共價鍵連接具有靶向功能的 Lf ，構(gòu)建一種新型的通過乳鐵蛋白受體介導的腦內(nèi)靶向遞藥系統(tǒng)（ Lf-PVs ）。Humanin（ HN ）是由 Hashimoto 等于 2001 年成功地通過功能篩選的方法得到的一種對阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 相關的細胞凋亡起特異阻斷作用的神經(jīng)保護肽， 由 24 個氨基酸組成， 是目前發(fā)現(xiàn)的唯一既能抑制 A淀粉蛋白又能抑制 FAD 基因突變誘發(fā)的神經(jīng)毒性作用的線性短肽。 HN 第 14 位的絲氨酸替換為甘氨酸得到 S14G-Humanin（S14G-HN），其神經(jīng)保護

11、作用是 HN 的 1000 倍。作為一種非常有前景的抗AD 藥物， S14G-HN 具有高特異性以及低劑量的特點，但同時也具有難以透過 BBB ，易于機體內(nèi)環(huán)境中代謝失活的缺點， 需要腦室內(nèi)注射給藥，靜脈給藥難以達到理想的治療效果 15,16 。結(jié)合多肽藥物腦部遞藥存在的問題及聚合物泡囊在藥物輸送中的特點，本研究采用離子梯度主動載藥法將S14G-HN 包載于Lf-PVs 內(nèi)制備載藥泡囊系統(tǒng) (S14G-HN-Lf-PVs) ，考察遞藥系統(tǒng)對記憶缺陷AD 模型大鼠的神經(jīng)保護作用。從而對 Lf-PVs 作為腦部多肽藥物遞送系統(tǒng)的可行性作出評價。1 材料與方法1.1試劑與儀器試劑：乳鐵蛋白（ Sig

12、ma 公司）； S14G-HN肽( 純度 >90%，杭州中肽生化有限公司 ) ；淀粉樣蛋白 Amyloid- 25-35（Sigma 公司）； MPEG-PLGA( Mr 3000:9000，自合成 ) ；maleimide-PEG-PLGA( Mr 3500:9000 ，自合成 ) ；Sepharose CL-4B(Pharmacia 公司 ) ；山羊抗乳鐵蛋白親和純化抗體（ BioVision 公司）；膠體金標記 IgG 抗體（ 10nm,Sigma公司）； 2-iminothiolane（ Traut s試劑， Sigma 公司）； Bax(P-19)兔多克隆抗體 ( Santa

13、Cruz公司 ) ；生物素標記二抗（ Immuno Research公司）； ABC 免疫組化試劑盒（ Vector 公司）；乙腈（ TEDIA 公司），其他試劑均為分析純。儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（ R-200，Buchi ，德國）；紫外分光光度儀（ UV-240 1PC，Shimadzu，日本）；粒度 /zeta 電位測定儀（ NICOMPTM380 ZLS ，NICOMP ，美國）；透射電鏡（ CM120， Philip ，荷蘭）；冷凍透射電鏡（ JEOL 2010，JEOL ，日本）；Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng) （DigBehv-MM ，上海吉量軟件科技有限公司） ；大鼠腦立體定位儀（江

14、灣 I-C 型，第二軍醫(yī)大學）；高效液相色譜儀（ LC-10A RF-10AXL ， Shimadzu, 日本）；倒置相差顯微鏡（ UFX-DX ，Nikon ，日本）。動物： SD 大鼠（ ，250g，中科院上海實驗動物研究中心提供)。1.2方法S14G-HN-Lf-PVs 的制備及表征制備 注入法制備 PVs，將 Maleimide-PEG-PLGA 與 MPEG-PLGA 一定比例混合，溶解于有機溶劑中，將溶液緩慢注入120 mmol·L -1（NH 4）2SO4 溶液中 7 ，靜置4h，旋轉(zhuǎn)揮發(fā)除去有機溶劑， Sepharose CL-4B 凝膠柱置換外水相為 0.01M 的

15、 Nacl 溶液，加入定量 S14G-HN 和 1,4-二氧雜環(huán)己烷 6 ，37孵育 20min，透析除去有機溶劑，過凝膠柱分離游離藥物得到未鏈接乳鐵蛋白的藥物泡囊（ S14G-HN-PVs）。將 Lf 溶解，按摩爾比加入 2-iminothiolane 得到巰基化 Lf ，將巰基化后的 Lf 以 Maleimide:-SH=1:1 加入已制備好的 S14G-HN-PVs 中，充氮室溫下緩慢反應 6h，得到 S14G-HN-Lf-PVs 10,11。表征 泡囊粒徑和 zeta 電位采用粒度 /Zeta 電位測定儀分析。1-2%（w/v ，pH7.0）磷鎢酸負染色后，透射電鏡下觀察泡囊形態(tài)。冷凍

16、透射電鏡觀察泡囊的膜層結(jié)構(gòu)。取 500L S14G-HN-Lf-PVs 稀釋液，加入山羊抗乳鐵蛋白純化抗體 5L ，37 搖床孵育 1h 后加入 50 L 膠體金標記兔抗山羊 IgG 抗體， 37 搖床孵育 2h，凝膠柱分離除去未結(jié)合的膠體金標記抗體，透射電鏡觀察 11。1.2.2 S14G-HN-Lf-PVs 的載藥量和包封率HPLC 法測定 S14G-HN 含量，色譜條件：色譜柱 Dikma Diamonsil C18 (5 m,200 mm×4.6 mm)；流動相 0.07 %三氟乙酸 : 乙腈（ 68: 32）；流速 1.0 mL/min ；檢測波長 210nm；進樣量 20

17、L ；柱溫 35。新鮮配制濃度范圍 10-1000g·mL -1的S14G-HN 去離子水溶液，制備標準曲線并且測定方法精密度。比濁法測定泡囊溶液的濃度，紫外吸收波長350nm，通過藥物濃度、聚合物泡囊的濃度以及投料量計算S14G-HN-Lf-PVs 的載藥量以及包封率。1.3S14G-HN-Lf-PVs 對 AD 大鼠的神經(jīng)保護作用-1大鼠 AD模型Amyloid- 25-35加入注射用水溶解，配制成2 g L· 溶液，密封-137振搖 76 h使其成凝聚態(tài)， -20保存?zhèn)溆谩?SD大鼠 20 %烏拉坦（800 mg kg· ，ip）麻醉后固定于腦立體定位儀上，

18、 頭頂部去毛 ,消毒皮膚 ,頭頂部正中切口 , 暴露前囟 ,選擇雙測海馬為注射靶區(qū)，以前囟為原點，向后3.0mm，左右各 2.0mm， 7號針頭鉆開顱骨，沿顱骨垂直向下進針3.2mm，于兩側(cè)海馬區(qū)各緩慢注入凝聚態(tài)Amyloid- 25-35 (2 g L-1·，5 L) ，留針 5 min后緩慢撤針，縫合切口，陰性對照組注射等量生理鹽水，動物蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng) 17 。實驗分組動物手術后隨機分成9 組，每組 8 只，與陰性對照組共10 組，常規(guī)飼養(yǎng) 14d 后尾靜脈注射連續(xù)給藥 12d，按照藥物濃度，給藥分組如下，陰性對照組 Sham control （生理鹽水， 1.2mL·

19、kg-1 ）；模型對照組 AD control （生理鹽水， 1.2 mL·kg-1）；8 個試驗組： S14G-HN 溶液組（50 g·kg-1）；低劑量 S14G-HN-PVs 組（2.5g·-1）；高劑量 S14G-HN-PVs 組（ 25 g·kg-1）；最低劑量 S14G-HN-Lf-PVs 組（2.5kgg·-1）；低劑量 S14G-HN-Lf-PVs 組（ 6.5 g·kg-1）；中劑量 S14G-HN-Lf-PVs 組（12.5kgg·kg-1）；高劑量 S14G-HN-Lf-PVs 組（ 25 g·kg-1）。1.3.3Morris 水迷宮試驗 動