歐洲藥典EP0細(xì)菌內(nèi)毒素中文

1、2.6.14 細(xì)菌內(nèi)毒素本法利用鯊試劑（從鯊 Limuluspolyhemus或Tachypleus tridentatus血細(xì)胞提取物（amoebocyte lysate ）制備而來）檢測由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素或?qū)?nèi)毒素進(jìn)行定量。該檢查包括三種方法：一為凝膠法，系利用鯊試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理；第二種為濁度法（基于內(nèi)源性底物斷裂后，產(chǎn)生的濁度變化）；最后一種為顯色法（得到的肽-呈色基團(tuán)復(fù)合物斷裂后，檢測反應(yīng)混合物的色度）。這一章闡述了下面 6種方法：方法A：凝膠法：限度試驗(yàn)方法B：凝膠法：半定量試驗(yàn)方法C:動(dòng)態(tài)濁度試驗(yàn)方法D：動(dòng)態(tài)顯色法方法E：終點(diǎn)顯色法方法F：終點(diǎn)濁度法檢測時(shí)

2、，可用6種方法的任一種進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測定結(jié)果可疑或有爭議時(shí)，除非另有規(guī)定，以專論中的方法 A的測定結(jié)果為準(zhǔn)。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止內(nèi)毒素的污染。儀器所有的玻璃器皿及由其他耐熱材料制成的器皿需用已驗(yàn)證的工藝在熱烘箱內(nèi)進(jìn)行去熱原處理。去熱原時(shí)，常用的最小時(shí)間和溫度設(shè)置分別為30分鐘和250C。若使用塑料器械，如微孔板和微量進(jìn)樣器配套的吸頭等，它們必須標(biāo)明無內(nèi)毒素并確對(duì)試驗(yàn)無干擾。注：這一章中，“管”的意思包括其他任何反應(yīng)容器，如微孔板中的孔。內(nèi)毒素儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備內(nèi)毒素儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液；所用的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品必須先用國際標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)， 如內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)BRP內(nèi)毒素以國際單位（IU）表示。IU的換算

3、見國際衛(wèi)生組織公布的國際標(biāo)準(zhǔn)。注：一國際單位（IU）內(nèi)毒素相當(dāng)于一個(gè)內(nèi)毒素單位（E.U.）。根據(jù)包裝說明書上的標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)毒素儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)簽上關(guān)于制備和貯存的說明。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備充分混合內(nèi)毒素儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液后，用細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢查用水（BET檢查用水）稀釋，制成適當(dāng)?shù)南盗邢♂屢?，即得BET檢查用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。得到的稀釋液應(yīng)盡快使用，以免因吸附而導(dǎo)致活性損失。供試品溶液的制備某些成分或除非另有說明，以BET檢查用水溶解或稀釋活性成分或藥品來制備供試品溶液。藥品可能在其它的水溶液中溶解度更高。如有必要，調(diào)節(jié)待測溶液（或它的稀釋液）的pH值，使鯊試劑和供試品溶液的混合物的pH值在所選鯊試劑生產(chǎn)

4、商的指定pH范圍內(nèi)。一般要求供試品溶液的pH值范圍為6.0 8.0?？捎悯徳噭┥a(chǎn)商推薦的酸、堿或適當(dāng)?shù)木彌_溶 液來調(diào)解pH值。酸或堿溶液須用 BET檢查用水在去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng) 過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。確定最大有效稀釋倍數(shù)最大有效稀釋倍數(shù)（MV»指可檢測出內(nèi)毒素限值的供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)。MVD按下列公式確定：MVD =內(nèi)毒素限值X供試品溶液濃度 /入內(nèi)毒素限值：在劑量的基礎(chǔ)上，注射藥物的活性成分的內(nèi)毒素限度為K/MK=A每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量（EU/kg）燮人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。專論中，注射劑的活性成分的內(nèi)毒素限度的單位有

5、IU/ml、IU/mg、IU/生物活性單位等。供試品溶液的濃度表示法：一當(dāng)內(nèi)毒素限度以質(zhì)量（IU/mg ）表示時(shí)，用 mg/ml表示濃度。-當(dāng)內(nèi)毒素限度以（IU/ml ）表示時(shí)，用 ml/ml表示濃度。-當(dāng)內(nèi)毒素限度以生物單位（IU/Unit ）表示時(shí)，用 Units/ml表示濃度。入=指凝膠法中鯊試劑的標(biāo)示靈敏度，或指濁度法或顯色法使用的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線上最低點(diǎn) （IU/ml）的對(duì)應(yīng)值。凝膠法（方法A和B）凝膠法系通過鯊試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或定量內(nèi)毒素的方法。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，可引起鯊試液凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鯊試劑的標(biāo)示靈敏度。為確保試驗(yàn)結(jié)果精確、有效，應(yīng)根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)中的說明開

6、展試驗(yàn)，復(fù)核鯊試劑的標(biāo)示靈敏度和試驗(yàn)的干擾因素。（1）預(yù)備試驗(yàn)（i ）鯊試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核試驗(yàn)靈敏度用IU/ml表示。應(yīng)在鯊試劑用于檢查內(nèi)毒素之前對(duì)靈敏度進(jìn)行復(fù)核；復(fù)核試驗(yàn)需要制備標(biāo)示靈敏度入的4支平行管。當(dāng)使用新批號(hào)的鯊試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn) 結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鯊試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。用BET檢查用水稀釋內(nèi)毒素儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成 2入、入、0.5入和0.25入四種濃度的標(biāo)準(zhǔn) 溶液。在每支試管中，分別混合等體積（通常為0.1mL）的鯊試液（lysate solution） 和標(biāo)準(zhǔn)溶液。如使用的是裝有鯊試劑凍干粉末的西林瓶或安甑，可向其中直接加入溶液。按照鯊試劑生產(chǎn)商的建議，將反

7、應(yīng)混合物孵育一段時(shí)間 （通常在37土 1C下保溫60± 2分鐘），在此過程中， 不能振動(dòng)試管。凝膠的完整性測試：如使用試管作為容器，先將試管從保溫箱中取出，再緩 緩將試管倒轉(zhuǎn)180°。如果形成了堅(jiān)實(shí)的凝膠，倒轉(zhuǎn)后凝膠不移位，此時(shí)將該項(xiàng)檢查的結(jié)果記 錄為陽性。如未能形成堅(jiān)實(shí)且不變形的凝膠，該項(xiàng)檢查的結(jié)果即為陰性。僅在最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的所有平行管的檢查結(jié)果均為陰性的情況下，試驗(yàn)方為有效。反應(yīng)終點(diǎn)濃度指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。將終點(diǎn)濃度取對(duì)數(shù)，計(jì)算它們的平均值，再將平均值的結(jié)果取反對(duì)數(shù)，最后的表達(dá)式如下：終點(diǎn)濃度的幾何平均值=lg -1（ s e/f）2

8、 e =所用系列溶液的終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值的和f=平行管的數(shù)量反應(yīng)終點(diǎn)的濃度的幾何平均值即為鯊試劑靈敏度的測量值（IU/ml ）。當(dāng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5入至2.0入之間時(shí)，可判定受試鯊試劑的標(biāo)示靈敏度為入，可用于內(nèi)毒素的檢查。（ii ）干擾因素試驗(yàn)按表2.6.14.-1 制備溶液A、8 G D。供試品的稀釋度不得超過MVD且供試品溶液不能檢查出內(nèi)毒素，具體操作見（1）預(yù)備試驗(yàn)，（i ）賞試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。表 2.6.14-1溶液內(nèi)毒素濃度 /配制內(nèi)毒 素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃 度平行管數(shù)A無/供試品一一一4溶液B2入/供試品供試品12入4溶液溶液21入440.5入4

9、80.25 入4C2入/BET檢BET檢12入2查用水查用水21入240.5入280.25 入2D0/BET檢查用水一一一2A盜檢查無內(nèi)毒素的溶液B=F擾實(shí)驗(yàn)用C兆試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照品D翔性對(duì)照品（BET檢查用水）根據(jù)（1）預(yù)備試驗(yàn)下的（i ）鯊試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)中列出的公式，計(jì)算 B和C 溶液的終點(diǎn)濃度的幾何平均值。如試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響到試驗(yàn)結(jié)果的變化，須重新進(jìn)行干擾因素試驗(yàn)。只有當(dāng)溶液A和D的所有平行管中無反應(yīng)、 且溶液C的結(jié)果在復(fù)核的鯊試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí),試驗(yàn)方有效。經(jīng)測定，如果溶液B的靈敏度在0.5入，2.0入間，可判定供試品溶液在該實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)實(shí)驗(yàn)無干擾；反之則判

10、定供試品溶液對(duì)試驗(yàn)?zāi)苄纬筛蓴_。若供試品溶液在小于 MVD勺稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過 MVD勺進(jìn) 一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。 使用靈敏度更高的賞試劑進(jìn)行內(nèi)毒素的檢查時(shí)，因?yàn)殪`敏度更高的鯊試劑能排除實(shí)驗(yàn)的干擾因素，供試品的稀釋倍數(shù)也可適當(dāng)放寬?？赏ㄟ^其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處 理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。(2) 限度試驗(yàn)(方法 A)(i )方法按表2.6.14-2制備溶液A B、C、D實(shí)驗(yàn)方法見(1)預(yù)備試驗(yàn)的(i)鯊試劑標(biāo)示靈敏度 的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。

11、表 2.6.14-2溶液內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A0/供試品溶 液2B2入/供試品 溶液2C2入/BET檢查用水2D0/BET檢查用水2制備溶液A、B (供試品陽性對(duì)照)，稀釋倍數(shù)不得超過 MVD按照(1)預(yù)備實(shí)驗(yàn)，(ii )干 擾因素實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的說明開展實(shí)驗(yàn)。溶液B、C (陽性對(duì)照)所含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的濃度為鯊試劑標(biāo)示靈敏度的兩倍。溶液 D (陰性對(duì)照)為 BET檢查用水。(ii )結(jié)果判斷只有溶液B和C的平行管的試驗(yàn)結(jié)果均為陽性、溶液D的平行管的試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，試驗(yàn)方有效。溶液A的平行管的試驗(yàn)結(jié)果均為陰性時(shí)，可判定供試品符合試驗(yàn)的內(nèi)毒素限度要求。如溶液的平行管的檢查結(jié)果均為陽性時(shí)

12、：- 如供試品的稀釋倍數(shù)為 MVD供試品不符合規(guī)定。- 如供試品的稀釋倍數(shù)小于 MVD應(yīng)將供試品溶液稀釋至較大但不超過MVD勺倍數(shù)，再次開展實(shí)驗(yàn)。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。如復(fù)試中，溶液A的兩個(gè)平行管均呈陰性，可將供試品判為符合內(nèi)毒素限度要求。（3）半定量試驗(yàn)（方法 B）（i ） 方法通過將供試品滴定至反應(yīng)終點(diǎn)，對(duì)供試品所含的細(xì)菌內(nèi)毒素定量。按表 2.6.14-3制備溶液A、B、G D。具體實(shí)驗(yàn)操作見（1）預(yù)備試驗(yàn)的（i ）鯊試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)。表 2.6.14-3溶液內(nèi)毒素濃度 /配制內(nèi)毒 素的溶液稀釋劑稀釋倍數(shù)稀釋后內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試

13、品BET檢查1一2溶液用水2-24-28-2B2入/供試品一12入2溶液C2入/BET檢BET檢查12入2查用水用水21入240.5入280.25 入2D無/BET檢查用水一一一2溶液A=不超過MV餅且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始，用BET檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，每一濃度準(zhǔn)備兩份稀釋液，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD并且確定稀釋液通過了干擾試驗(yàn)。也可以準(zhǔn)備其它合適倍數(shù)的稀釋液。溶液B=2入濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液 A （供試品陽性對(duì)照）溶液C雄有2入、入、0.5入和0.25入濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的 BET檢查用水系列，每一濃度準(zhǔn)備兩份。溶液D=BE磴查用水（陰性對(duì)照

14、）（ii ）計(jì)算和結(jié)果判斷符合下列三個(gè)條件時(shí)，可將試驗(yàn)判為有效：（a）溶液D （陰性對(duì)照）的兩組平行管均顯陰性，（b）溶液B （供試品陽性對(duì)照）的兩個(gè)平行管均顯陽性，（c） 溶液C的終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.5入一2入之間。測定溶液A的內(nèi)毒素濃度，計(jì)算溶液A的系列稀釋液的終點(diǎn)濃度時(shí)，應(yīng)將內(nèi)毒素濃度記為終 點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以入。供試品的內(nèi)毒素濃度指這些平行管的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（見（1）預(yù)備試驗(yàn)項(xiàng)下的（i ）鯊試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下的公式）。如實(shí)驗(yàn)使用的是供試品的稀釋液，計(jì)算時(shí),將檢查結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，即得到原始溶液的內(nèi)毒素濃度。如在有效的實(shí)驗(yàn)中，供試品的檢查結(jié)果均顯陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃

15、度小于入（如實(shí)驗(yàn)使用的是供試品的稀釋液，檢查結(jié)果應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于入乘以供試品的最小稀釋倍數(shù)）。如供試品的所有結(jié)果均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以入（如，在表2.6.14-3中，初始稀釋倍數(shù)X 8X入）。如內(nèi)毒素的濃度小于其專論中的規(guī)定濃度，可判定供試品符合檢查要求。光度測定法（方法 G以E和F）（1）濁度法（方法C和F）本法是利用光學(xué)試驗(yàn)來測定濁度增加的方法。根據(jù)檢測原理，這種方法又可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法（方法 F）系依據(jù)反應(yīng)混合物在孵育終止時(shí)，反應(yīng)混合物的濁度（吸光度或透光 率）與內(nèi)毒素濃度之間的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法（方法 C

16、）是檢測反應(yīng)混合物的濁度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定 的吸光度需要的反應(yīng)時(shí)間（起效時(shí)間，onset time ）,或是檢測濁度變化率。根據(jù)鯊試劑生產(chǎn)商的建議，光度測定試驗(yàn)應(yīng)在孵育溫度下進(jìn)行（通常為37± 1C）。（2）顯色法（方法D和E）該法系利用檢測鯊試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素的含量 的方法。根據(jù)檢測原理，這種方法又可分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法（方法 E）是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的呈色團(tuán)的 量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法（方法 DD是檢測反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)定吸光度（或透光率

17、）所需要的 反應(yīng)時(shí)間（起效時(shí)間，onset time ）,或檢測色度增長速度的方法。根據(jù)鯊試劑生產(chǎn)商的建議，光度測定試驗(yàn)應(yīng)在孵育溫度下進(jìn)行（通常為37± 1C）。（3）預(yù)備試驗(yàn)為確保濁度法和顯色法試驗(yàn)結(jié)果精確、有效，應(yīng)根據(jù)下面的說明，預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性和干擾因素試驗(yàn)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需要驗(yàn)證試驗(yàn)方法。（i ）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液制成至少三個(gè)濃度的稀釋液，以獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照鯊試劑生產(chǎn)商的建議（體積比、孵育時(shí)間、溫度、pH等），每一內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液至少做三支平行管。使用動(dòng)態(tài)法檢測時(shí)，如預(yù)期范圍超過2 log，為使標(biāo)準(zhǔn)曲線反映出每

18、個(gè)對(duì)數(shù)增長（logincrease ）,應(yīng)相應(yīng)增加標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在鯊試劑生產(chǎn)商規(guī)定的內(nèi)毒素濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值I r |必須大于等于0.980。（ii ） 干擾因素試驗(yàn) 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度。 按表2.6.14-4制備溶液A、B、C、Db在鯊試劑生產(chǎn)商的建議測試條件（供試品和鯊試液體 積、供試品于鯊試液的體積比、孵育時(shí)間等）下，對(duì)這些溶液開展試驗(yàn)，每種溶液至少做兩 組平行。表 2.6.14-4溶液內(nèi)毒素濃 度配制內(nèi)毒素的溶液平行管或 微孔數(shù)A無供試品溶液不少于2 個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)曲線 的中點(diǎn)供試品溶液不少于2 個(gè)C至少3個(gè) 濃度（最 低濃度規(guī) 定為入）BET檢查用水每一濃度

19、不少于2個(gè)D0BET檢查用水不少于2 個(gè)溶液A=稀釋倍數(shù)不超過 MVD勺供試品溶液。溶液B=加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線終點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的一個(gè)已知濃度內(nèi)毒素的、且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。 溶液。=如“3.預(yù)備實(shí)驗(yàn)（i ）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”項(xiàng)下描述的、用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液。溶液D=BE磴查用水（陰性對(duì)照）用含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的平均內(nèi)毒素含量減去供試品溶液的平均內(nèi)毒素含量，計(jì)算內(nèi)毒素的平均回收率。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在 50% 200%之間時(shí)，可認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液中不存在干擾 因素。在溶液中不添加任何內(nèi)毒素的條件下，計(jì)算任何所測內(nèi)毒素的減少。當(dāng)內(nèi)毒素的回收率不在指定范圍內(nèi)，

20、應(yīng)根據(jù)凝膠法章節(jié)的 “1.預(yù)備實(shí)驗(yàn)（ii ）干擾因素實(shí)驗(yàn)”項(xiàng)下的說明排除干擾因素。重復(fù)干擾因素實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證處理的有效性。（4）檢查法（i ）方法按“（3）預(yù)備試驗(yàn)下的（ii ）干擾因素試驗(yàn)”項(xiàng)下操作步驟。（ii ）計(jì)算用系列溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液 A的每一個(gè)平行管的內(nèi)毒素濃度。試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方有效。a. 溶液D （陰性對(duì)照）的試驗(yàn)結(jié)果不得大于所用鯊試劑的說明書中規(guī)定的空白值的限度。b. 陽性對(duì)照系列溶液 C的檢查結(jié)果要符合“ 3.預(yù)備實(shí)驗(yàn)（i ）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)”中 的要求。c. 用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后，計(jì)算出的回收率在50% 一200%的范圍內(nèi)。(

21、iii )結(jié)果判斷若校正了稀釋倍數(shù)和濃度后，由溶液A的內(nèi)毒素濃度計(jì)算得到的供試品內(nèi)毒素平均濃度小于供試品的內(nèi)毒素限度，可判斷供試品符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的要求。(5) 試劑(i )鯊試液根據(jù)鯊試劑生產(chǎn)商的建議，用BET檢查用水或緩沖液溶解鯊試劑，輕輕攪拌。根據(jù)鯊試劑生產(chǎn)商的建議，在冷凍或冰凍條件下貯存鯊試液。(ii ) 鯊試劑鯊試劑系從鯊(Limuluspolyhemus或Tachypleus tridentatus )的變形細(xì)胞溶解物制備而 來。該試劑僅指在符合有關(guān)權(quán)威法規(guī)的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的鯊試劑產(chǎn)品。鯊試劑除了能與內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)外， 也能與某些3-葡聚糖反應(yīng)。制備不與3-葡聚糖反應(yīng)的 鯊試劑時(shí)

22、，需用鯊變形細(xì)胞溶解物中除去可與3-葡聚糖反應(yīng)的G因子，或抑制 G因子反應(yīng)系統(tǒng)，這樣制備得到的鯊試劑可在葡聚糖存在的情況下檢測內(nèi)毒素。(iii )BET檢查用水(細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)BET檢查用水指 注射用水R或由其他方法制取的內(nèi)毒素含量低于所用鯊試劑的檢測限的水。下面的章節(jié)提供了相關(guān)信息。細(xì)菌內(nèi)蠹素檢查法：指導(dǎo)原則1. 簡介革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素是受熱原污染的藥品引發(fā)毒性反應(yīng)的最常見原因，它產(chǎn)生的熱原的活性比其他來源的熱原的活性要高出許多，這些內(nèi)毒素屬于脂多糖類。雖然也有少數(shù)的熱原屬于其他物質(zhì)，在排除非內(nèi)毒素的熱原物質(zhì)的前提下，調(diào)查結(jié)果通常顯示：不含細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)品中也不存在熱原。干擾因素

23、會(huì)影響內(nèi)毒素與鯊試劑之間的反應(yīng)，所以它們的存在可能會(huì)掩蓋產(chǎn)品中存在熱原的事實(shí)。因此，希望用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查代替藥典要求的家兔熱原檢查法的分析人員必須證明細(xì) 菌內(nèi)毒素檢查法對(duì)供試品有效，而這種做法成功的必要條件之一是除去干擾因素。根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求，在該檢查法的使用能被視為有效之前，必須給出下面2個(gè)方面的資料。1.1試驗(yàn)用到的材料符合該檢查法的要求。必須保證BET檢查用水和其他試劑不含內(nèi)毒素，鯊試劑的靈敏度的檢查結(jié)果必須與其生產(chǎn)商聲明的靈敏度一致。1.2考慮到待檢產(chǎn)品可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)造成的干擾，必須在存在和不存在待檢產(chǎn)品的情況下分別開展試驗(yàn)，測量兩組實(shí)驗(yàn)中鯊試劑的靈敏度；測定的2個(gè)靈敏度的值不

24、得有明顯差異。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(2.6.14 )中闡述了排除干擾因素的方法。在存在干擾因素的情況下，在證明是否已經(jīng)中和或除去了該方法的干擾因素之后，必須再開展一次試驗(yàn)。附錄列舉了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的各項(xiàng)要求的原因，以及結(jié)果的解釋。如果以鯊試劑檢查法作為分析的供選方法，取代藥典專論中的家兔熱原檢查法，需要驗(yàn)證此種想法的可行性。11章給出了如何進(jìn)行驗(yàn)證的一些指導(dǎo)原則。細(xì)菌內(nèi)毒素的參考方法見產(chǎn)品專論。在專論沒有特別說明的情況下，以方法A為參考。如意圖使用參考方法以外的其它方法，分析人員必須證明這種方法對(duì)該待檢產(chǎn)品的適用性， 并表明這種方法與參考方法在檢查結(jié)果上的一致性（見13章）。2, 方法向鯊試劑中

25、加入內(nèi)毒素會(huì)引起濁度的變化、沉淀的生成或引發(fā)凝集反應(yīng)；藥典之所以選擇凝膠法作為細(xì)菌內(nèi)毒素的第一類檢查的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，是因?yàn)樵摲ㄔ谂袛喙┰嚻肥欠窈细裆洗嬖诤喢餍缘膬?yōu)勢(shì)：用肉眼即可觀察到是否有凝膠生成。方法C、以E、F均為稍后研發(fā)出的定量方法：這些方法有較多的儀器要求，但如果是同種產(chǎn)品的大量樣品的常規(guī)自動(dòng)化檢查，使用它們就較為簡便。某些塑料或玻璃制成的試管或吸量管的表面可能會(huì)吸附內(nèi)毒素，而塑料釋放的物質(zhì)又可能會(huì)引發(fā)干擾因素的出現(xiàn)。 所以，應(yīng)檢查所用的材料。 考慮到之后批次的試管或吸量管可能會(huì)與 之前的批次在組分上有輕微的差異，因此，建議檢驗(yàn)員在使用新的批次的試管或吸量管進(jìn)行試驗(yàn)之前，先要重復(fù)材料的檢查

26、試驗(yàn)。首先，應(yīng)將細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法用作限度試驗(yàn)，測出待檢產(chǎn)品的內(nèi)毒素濃度的限值；接下來的檢查目標(biāo)是判斷待檢產(chǎn)品的內(nèi)毒素濃度是否在限值的范圍內(nèi)。定量方法C、D、E、F用于確定供試品中內(nèi)毒素的含量；不管是藥典還是常規(guī)質(zhì)量控制，它們的最終疑問都是內(nèi)毒素的含量是否超過了指定限度。設(shè)定待檢產(chǎn)品的內(nèi)毒素的濃度限值時(shí)，應(yīng)將供試品的劑量納入考慮范圍；限值的設(shè)定值應(yīng)能確保：只要產(chǎn)品的內(nèi)毒素濃度小于限值，即使在指定的給藥途徑以每小時(shí)最大的給藥劑量服藥，也不會(huì)引起毒性反應(yīng)。產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量近似等于限值時(shí)，如果內(nèi)毒素的濃度較高， 會(huì)出現(xiàn)凝膠，產(chǎn)品的檢查結(jié)果會(huì)不合格，這是由該檢查法的性質(zhì)決定的：要么出現(xiàn)反應(yīng)，要么完全沒有

27、反應(yīng)。因此，該檢 查法不能區(qū)分接近限值 （小于限值）和稍高于限制的內(nèi)毒素濃度。但只要沒有凝膠出現(xiàn)，檢驗(yàn)員即可判定供試品的內(nèi)毒素濃度低于限值。就固體產(chǎn)品而言，每質(zhì)量單位或每國際單位產(chǎn)品中內(nèi)毒素的濃度限值應(yīng)換算成每毫升供試品 溶液的內(nèi)毒素濃度表示方式。因?yàn)樵摲椒ㄖ荒茉谝后w狀態(tài)下使用。液體供試品（如輸液制劑）的相關(guān)討論如下。內(nèi)毒素限值：在劑量的基礎(chǔ)上，注射藥物的活性成分的內(nèi)毒素限度為K/MK=A每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量（EU/kg）燮人用每公斤體重每小時(shí)的最大供試品劑量。內(nèi)毒素限值依產(chǎn)品專論中的給藥途徑和劑量而定。K的值見表2.6.14-15 。表 2.6.14-5給藥途徑K （內(nèi)毒素

28、IU/公斤體重/ 小時(shí)）靜脈注射5.0放射性藥物的靜脈注射2.5鞘內(nèi)注射0.2如產(chǎn)品的稀釋液在試驗(yàn)中得到了陰性結(jié)果,意味著獲得了最大程度的保證？陰性結(jié)果是否代表供試品的內(nèi)毒素濃度低于內(nèi)毒素限度，而陽性結(jié)果又是否表示賞試劑檢測到的內(nèi)毒素濃度近似等于或高于內(nèi)毒素限度？這一點(diǎn)由鯊試劑的靈敏度和內(nèi)毒素限度決定:最大稀釋度（MVD和它的計(jì)算式如下：MVD =內(nèi)毒素限值X供試品溶液濃度 /入供試品溶液的濃度：一當(dāng)內(nèi)毒素限度以質(zhì)量（IU/mg ）表示時(shí)，用 mg/ml表示濃度。-當(dāng)內(nèi)毒素限度以生物活性（IU/Unit ）表示時(shí)，用 Units/ml表示濃度。-當(dāng)內(nèi)毒素限度以體積（IU/ml ）表示時(shí)，用 m

29、l/ml表示濃度。入=指凝膠法中鯊試劑的標(biāo)示靈敏度，或指濁度法或顯色法使用的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線上最低點(diǎn) （IU/ml）的對(duì)應(yīng)值。如最大有效稀釋倍數(shù)不為整數(shù)，為了日常使用的便利， 可取稍小于 MVD勺整數(shù)值（如此一來，制備的供試品溶液的稀釋倍數(shù)會(huì)小于MVD。此時(shí)，檢查的陰性結(jié)果表示內(nèi)毒素的濃度低于限值。不過，如果供試品的內(nèi)毒素濃度低于內(nèi)毒素限度，但足以與鯊試劑引發(fā)凝膠反應(yīng)，在該試驗(yàn)條件下，檢查結(jié)果呈陽性。在這種情況下，以“便利”的稀釋倍數(shù)稀釋的供試品的檢 查結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)將供試品以 MV商釋，重復(fù)試驗(yàn)。只要檢查結(jié)果存在爭議，就必須采用MVDS行稀釋。這也突出了賞試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的重要性。例待檢品為

30、50mg/ml的苯妥因鈉溶液（靜脈注射用）。計(jì)算MVD變量數(shù)據(jù)如下：M =最大人用劑量=15mg每千克體重每小時(shí)，C = 50 mg/ml,K = 5 IU 內(nèi)毒素每千克體重每小時(shí)，入=0.4IU 內(nèi)毒素每毫升m 5 x 5U 1MVD - x - 4J .67 150*4在該產(chǎn)品的日常檢驗(yàn)中，將1ml供試品溶液稀釋至 20ml是方便的做法（MVD/2后，得到的值取最接近的較小的整數(shù)）。但是，如果以該稀釋倍數(shù)稀釋供試品，得到的檢查結(jié)果呈陽性 且可疑的話，檢驗(yàn)員有必要將1ml稀釋至41.67ml。3. 參照標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)BRPB明了參照標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。它已用內(nèi)毒素WH(®際標(biāo)準(zhǔn)品測

31、定了含量，它的效價(jià)單位以內(nèi)毒素國際單位 /安甑表示。內(nèi)毒素國際單位定義為一定量的國際標(biāo)準(zhǔn)品的 活性。就日常使用而言，也可使用另一種內(nèi)毒素制劑，只要選用的內(nèi)毒素制劑已用內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品或BRP標(biāo)準(zhǔn)品測定了含量，且它的效價(jià)單位以內(nèi)毒素國際單位表示。注：1國際單位(IU)等于1內(nèi)毒素單位(E.U.)。4. BET用水基于實(shí)踐和理論原因，用家兔熱原檢查法衍生的方法來檢查試劑中內(nèi)毒素的含量是不可取 的，因?yàn)椋?.1用于對(duì)產(chǎn)品開展測試的 BET檢查用水的內(nèi)毒素含量限值相當(dāng)?shù)?，家兔檢查法的靈敏度不足以檢測BET檢查用水的內(nèi)毒素。4.2家兔體溫的升高的精確度相對(duì)較低，因此需要在多只家兔身上開展平行試驗(yàn)。4.3

32、 “熱原”和“內(nèi)毒素”所指物質(zhì)的涵蓋范圍并不完全重合。根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的具體內(nèi)容，可以看出BET檢查用水的制備方法并不是三次蒸儲(chǔ)。在這里，使用反滲透技術(shù)的優(yōu)勢(shì)很明顯，也有些檢驗(yàn)員認(rèn)為蒸儲(chǔ)次數(shù)大于三次是較好的方法。不論使用哪種方法，得到的產(chǎn)物不能檢測出內(nèi)毒素。5. 混合物的pH值檢查細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)，pH值在6.0-8.0 之間時(shí)，獲得的凝膠最為理想。不過，要注意的是， 供試品中添加的鯊試劑可能會(huì)導(dǎo)致pH值的降低。6. 鯊試劑的驗(yàn)證在這一點(diǎn)上，按照生產(chǎn)商的說明制備鯊試液非常重要。凝膠法中，A和B的陽性結(jié)果的反應(yīng)終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)需要轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)形式，原因如下：如果 對(duì)這些對(duì)數(shù)值的分布頻率作圖，得到的曲

33、線通常更接近正態(tài)分布曲線，而不是稀釋倍數(shù)的分布頻率曲線；這兩條曲線非常相似，以至于可以使用正態(tài)分布曲線作為數(shù)學(xué)模型、利用 Student ' s t-檢驗(yàn)來計(jì)算置信限。7. 干擾因素的預(yù)備試驗(yàn)有些產(chǎn)品不能與試劑混溶，不能將它們的pH值調(diào)節(jié)至6.0-8.0之間，甚至有些產(chǎn)品本身就能抑制或激發(fā)凝膠反應(yīng)，因而不能直接檢測它們的內(nèi)毒素含量?？紤]到這些問題，需要事先開展干擾因素試驗(yàn)，確定供試品是否能形成這些干擾。如果檢驗(yàn)員發(fā)現(xiàn)了這些干擾因素，接下來必須證明這些干擾因素的排除方法的有效性。預(yù)備試驗(yàn)的目的是在供試品存在和不存在兩種情況下，檢查鯊試劑的靈敏度是否有明顯差異，即檢查零假設(shè)是否成立。 方法

34、A和B中對(duì)此有項(xiàng)簡單的判定標(biāo)準(zhǔn)：如果在存在供試品的情況下，鯊試劑的靈敏度與不存在供試品的情況下的靈敏度的比值在0.5-2之間，可判定零假設(shè)成立。Student ' s t -檢驗(yàn)法是處理這個(gè)問題的經(jīng)典方法，它能計(jì)算存在與不存在供試品時(shí)的稀釋 倍數(shù)的對(duì)數(shù)值的平均值，檢查這兩個(gè)平均值的差異， 從而實(shí)現(xiàn)了檢查鯊試劑的靈敏度的目的。凝膠法A和B的干擾因素試驗(yàn)要求供試品的內(nèi)毒素不可檢出。因此，全新的產(chǎn)品必須檢測內(nèi)毒素，這是理論上的要求。此外，方法C、以E、F為定量方法。8. 干擾因素的排除排除干擾因素的方法不得對(duì)供試品的內(nèi)毒素的含量造成增減（例如吸附）。檢查的正確做法是，使用供試品的加標(biāo)樣（即添

35、加了已知量內(nèi)毒素的樣品），然后計(jì)算內(nèi)毒素的回收率。方法c和a如果供試品的性質(zhì)使得經(jīng)典方法的應(yīng)用不能排除干擾因素，可用適當(dāng)方法或稀 釋法去除供試品的內(nèi)毒素，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢查內(nèi)毒素時(shí)，可將檢查結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，達(dá)到檢查的目的。用三醋酸纖維素非對(duì)稱膜進(jìn)行超濾是大多數(shù)情況下都適用的方法。在某些情況下，纖維素的衍生物（3 -葡聚糖）可導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，因此，過濾裝置需要適當(dāng)驗(yàn)證。經(jīng)證實(shí)，聚硯膜過濾裝置不適用于該項(xiàng)檢查；某些使用者發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。9. 對(duì)照品的用途制備BET檢查用水制成的對(duì)照品和用內(nèi)毒素參照標(biāo)準(zhǔn)品制成的濃度為鯊試劑標(biāo)示靈敏度的兩倍的對(duì)照品，其目的在于驗(yàn)證鯊試劑在試驗(yàn)條件下和試驗(yàn)當(dāng)時(shí)的活性。制備陰性對(duì)照品的目的在于驗(yàn)證 BET檢查用水不可檢出內(nèi)毒素。陽性對(duì)照品所含的內(nèi)毒素濃度與待檢供試品所含的內(nèi)毒素濃度一致，它的試驗(yàn)結(jié)果能證明在試驗(yàn)條件下和試驗(yàn)當(dāng)時(shí)，不存在干擾因素。10. 結(jié)果判斷和解釋檢查時(shí)，盡管BET檢查用水或其他試劑、材料在試驗(yàn)過程中會(huì)與鯊試劑接觸， 只要它們攜帶 的微量內(nèi)毒素沒有達(dá)到鯊試劑靈敏度的限值， 就不能被檢測出來。 但是，它們攜帶的內(nèi)毒素 可能會(huì)導(dǎo)致供試品溶液中內(nèi)毒素含量的增大， 甚至可能會(huì)高于靈敏度限值， 最終引發(fā)陽性反 應(yīng)。用能