第十三章 基因工程

1、1第十三章第十三章 病毒基因工程病毒基因工程生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 李李 灝灝 2目前病目前病毒基因毒基因工程正工程正沿著二沿著二個(gè)方向個(gè)方向 發(fā)展發(fā)展 一是將編碼病毒表面抗原的基因移植到質(zhì)粒中去，在大腸桿菌中產(chǎn)生大量表面抗原物質(zhì)，以制備疫苗或診斷用抗原。如乙型肺炎病毒編碼表面抗原的DNA片段已在酵母菌中表達(dá)，該疫苗正進(jìn)行人體觀察 二是探索病毒作為基因工程載體的可能性，以便將所需要的外源基因帶入人體或其余生物體內(nèi)，以治療人類遺傳疾病或創(chuàng)造動(dòng)物新品種的目的3第一節(jié)第一節(jié) 病毒載體病毒載體第二節(jié)第二節(jié) 基因工程病毒疫苗基因工程病毒疫苗第三節(jié)第三節(jié) 病毒與基因治療病毒與基因治療第四節(jié)第

2、四節(jié) 病毒與生物防治病毒與生物防治4第一節(jié)第一節(jié) 病毒載體病毒載體 病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)載體的特點(diǎn)： (1) 具有能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別的有效啟動(dòng)子； (2)在感染周期中能持續(xù)復(fù)制； (3)有些病毒具有控制復(fù)制的順式和反式作用因 子，能在胞內(nèi)使外源基因長(zhǎng)期高拷貝復(fù)制； (4)能高效整合到宿主基因組，可提高外源基因整 合到宿主細(xì)胞染色體的效率； (5)病毒衣殼蛋白能夠識(shí)別細(xì)胞接受器，可將外源 基因高效導(dǎo)入寄主細(xì)胞。5一、動(dòng)物病毒載體一、動(dòng)物病毒載體1、SV40載體載體 SV40病毒基因組是環(huán)狀雙鏈DNA，大小僅為5243bp，與質(zhì)粒大小相似，適于基因操作。 SV40在感染敏感宿主細(xì)胞后，其基因

3、組DNA進(jìn)入細(xì)胞核，首先啟動(dòng)早期基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)出早期基因t抗原和T抗原，當(dāng)這2種蛋白質(zhì)積累到一定程度時(shí)DNA開始復(fù)制，同時(shí)開始驅(qū)動(dòng)病毒晚期基因轉(zhuǎn)錄，翻譯產(chǎn)生VP1、VP2和VP3等病毒衣殼蛋白，并開始進(jìn)行病毒粒子的裝配。當(dāng)病毒粒子數(shù)量積累到一定量時(shí)，細(xì)胞裂解釋放出子代病毒粒子。6 SV40病毒不能攜帶大于本身基因組的DNA分子，因此，外源基因只能通過取代病毒本身的DNA片段進(jìn)行克隆。 以SV40病毒為基礎(chǔ)的克隆載體主要有2種不同類型： （1）置換型重組病毒載體）置換型重組病毒載體 外源DNA插入缺陷性的病毒基因組中。 根據(jù)置換位置不同分為： 早期置換型 晚期置換型 （2）重組的病毒）

4、重組的病毒-質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 載體只保留復(fù)制序列，無(wú)衣殼蛋白，不能產(chǎn)生病毒粒子，但可進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生很多拷貝，所以依然可以高水平表達(dá)外源基因。72、痘苗病毒載體痘苗病毒載體 屬于感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雙鏈線性DNA病毒，基因組在180kb左右，其中30kb左右為非必需區(qū)，可以被外源DNA片段取代而不影響復(fù)制與增殖。 特點(diǎn)特點(diǎn)： * 容易培養(yǎng)，相當(dāng)穩(wěn)定，能在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中復(fù)制繁殖。 * 由于其基因組很大，因此只能先將目的基因克隆 到轉(zhuǎn)移載體上，然后將充足轉(zhuǎn)移載體與野生性痘 苗病毒DNA共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā) 生同源重組而獲得重組痘苗病毒。 * 高效，能同時(shí)預(yù)防幾種病原物引起的傳染病。

5、83、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體 為單鏈RNA病毒，可高效感染許多宿主細(xì)胞。 病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核并整合在染色體上，且以此為模板合成病毒蛋白及子代基因組RNA，然后裝配成病毒顆粒。 反轉(zhuǎn)錄基因組含反轉(zhuǎn)錄基因組含3個(gè)最重要的基因個(gè)最重要的基因: gag (編碼核心蛋白) pol (編碼轉(zhuǎn)錄酶) env (編碼病毒外膜蛋白) 依次由5向3方向排列。Env基因中含有病毒包裝 所必須的序列 兩端存在長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)（LTR），用于介導(dǎo)病毒的整合。9 4、腺病毒載體、腺病毒載體 其基因組為線狀雙鏈DNA。能廣泛感染各種分化或未分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞?；蚪M長(zhǎng)

6、36kb，兩段各有一個(gè)反向末段重復(fù)序列(ITR)，ITR內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號(hào)。 基因組上分布著4個(gè)承擔(dān)調(diào)節(jié)功能的早期基因E1、 E2、E3、E4和1個(gè)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的晚期基因 缺點(diǎn)缺點(diǎn): : 能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并存在安全性問題。 通過改造，目前腺病毒載體已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì) 表達(dá)、RNA干擾、基因治療載體、腫瘤治療和疫苗的 研制等。 105、單純皰疹病毒載體、單純皰疹病毒載體(HSV) 中等大小的雙鏈DNA病毒，有囊膜，外形呈二十面體對(duì)稱，直徑120-200nm優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 基因組龐大，并已完成全序列測(cè)定，只用于大范圍基因操作，可插入30kb以上的外源DNA。 可感染脊椎動(dòng)物多種類型的細(xì)胞，具

7、有嗜神經(jīng)性，為目前唯一適合于神經(jīng)細(xì)胞的病毒載體。 在神經(jīng)元內(nèi)能進(jìn)入潛伏狀態(tài)，部分基因可保持轉(zhuǎn)錄活性而不影響神經(jīng)元的正常功能。 11HSV載體分為兩大類載體分為兩大類: :重組質(zhì)粒型載體重組質(zhì)粒型載體 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：構(gòu)建過程相對(duì)簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：重組質(zhì)粒DNA攜帶外源基因的容量有限，而且包裝效率不如病毒 DNA重組病毒型載體重組病毒型載體 直接利用經(jīng)改造的病毒基因組作為載體。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：在神經(jīng)元內(nèi)能真正進(jìn)入潛伏狀態(tài)，能攜帶多個(gè)外源基因，無(wú)須輔助病毒，傳遞效率相當(dāng)高。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：病毒基因組內(nèi)的毒性元件和轉(zhuǎn)錄因子可能影響細(xì)胞代謝乃至殺死細(xì)胞，外源基因表達(dá)水平低。126、桿狀病毒載體桿狀病毒載體 基因組為雙

8、鏈閉合環(huán)狀DNA，大小為90-180kb，在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物。具有高度的宿主特具有高度的宿主特異性異性，對(duì)人和哺乳動(dòng)物十分安全，常做生物殺蟲劑。 (1) 桿狀病毒表達(dá)載體的強(qiáng)啟動(dòng)子桿狀病毒表達(dá)載體的強(qiáng)啟動(dòng)子 多角蛋白啟動(dòng)子 (2) 外源基因插入桿狀病毒載體的方式外源基因插入桿狀病毒載體的方式 將轉(zhuǎn)移載體和親本病毒進(jìn)行同源重組 13(3) 桿狀病毒載體的優(yōu)點(diǎn)：桿狀病毒載體的優(yōu)點(diǎn)： 載體安全性高 具有克隆大片段外源基因能力 表達(dá)效率高 表達(dá)產(chǎn)物具有正確的后加工 病毒具有自主感染性 能成為蟲體生物反應(yīng)器14二、植物病毒載體二、植物病毒載體 由于植物病毒多為RNA病毒，植物細(xì)胞的特殊性造成細(xì)胞培

9、養(yǎng)不如動(dòng)物細(xì)胞方便，使得載體構(gòu)建比較困難，因此其載體研究開展較晚，直到1984年才由植物病毒花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)成功構(gòu)建載體。15 植物病毒載體主要有置換型載體、插入型載體和互補(bǔ)型載體3種類型。 置換型載體置換型載體即用外源基因置換植物病毒基因組復(fù)制和繁殖的非必需區(qū)。 插入型載體插入型載體的構(gòu)建方式是將外源編碼序列插入病毒基因組不重要的非編碼區(qū),以避免對(duì)病毒的復(fù)制或移動(dòng)造成不利影響。 互補(bǔ)型載體互補(bǔ)型載體是將外源基因插入缺陷型病毒或用外源基因置換病毒的某個(gè)基因,在構(gòu)建互補(bǔ)型載體時(shí),一些重要基因也被外源基因置換或插入。16三、噬菌體載體三

10、、噬菌體載體 噬菌體又稱細(xì)菌病毒。由于噬菌體和細(xì)菌的密切關(guān)系，成為生物學(xué)研究的極好材料，同時(shí)也和分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展密切相關(guān)。DNA復(fù)制機(jī)理的闡明、轉(zhuǎn)錄的終止作用、連接酶和解旋酶的發(fā)現(xiàn)、位點(diǎn)特異性重組作用、SOS修復(fù)機(jī)制等，均是以噬菌體為材料取得的重要研究成果。根據(jù)噬菌體復(fù)制和生活周期等特點(diǎn)，已經(jīng)構(gòu)建了許多噬菌體載體，并廣泛用于基因克隆、表達(dá)、基因組文庫(kù)構(gòu)建等，是基因工程中不可缺少的優(yōu)良載體。17第二節(jié)第二節(jié) 基因工程病毒疫苗基因工程病毒疫苗 病毒疫苗被公認(rèn)為預(yù)防和控制病毒的最好甚至唯一的出路。 疫苗(vaccine)是人類在同烈性傳染病的不斷抗?fàn)幹兄饾u被發(fā)現(xiàn)和利用的。 傳統(tǒng)疫苗

11、主要是滅活或減毒的病原物，這種疫苗因具有病原物的所有抗原成分，能激發(fā)很強(qiáng)的免疫保護(hù)力。18傳統(tǒng)疫苗在疾病的預(yù)防中有局限性傳統(tǒng)疫苗在疾病的預(yù)防中有局限性1、不論滅活還是減毒的病毒疫苗，都必須經(jīng)培養(yǎng)動(dòng)物或細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)，產(chǎn)量低，成本高，生產(chǎn)人員需要防護(hù)；2、生產(chǎn)出的死疫苗存在滅活不徹底的危險(xiǎn),而減毒疫苗有回復(fù)突變的危險(xiǎn)存在；3、有些疾病如愛滋病，用傳統(tǒng)的疫苗預(yù)防效果收效甚微。19 從20世紀(jì)80年代中期開始，DNA重組技術(shù)的日益成熟為制造新一代重組疫苗提供了嶄新的方法，研究人員可用基因工程技術(shù)改造、設(shè)計(jì)和生產(chǎn)理想的疫苗。 1、通過刪除野生型病毒中毒性基因制備弱 毒疫苗。 2、活體重組疫苗。20第三節(jié)第

12、三節(jié) 病毒與基因治療病毒與基因治療21 概念概念: : 基因治療是基于核酸的治療,將遺傳物質(zhì)(DNA或RNA)轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療,其本質(zhì)是利用正?；蚋鼡Q人體內(nèi)有缺陷或變異基因的治療方法。 原因原因: : 許多人類疾病都是由于某種蛋白質(zhì)的缺乏或者表達(dá)引起的,為了補(bǔ)償這種蛋白質(zhì)的缺乏,可以針對(duì)性地加入這種蛋白質(zhì)進(jìn)行治療,而基因治療是終極的蛋白質(zhì)加入方案。22目前用于基因治療的載體分為目前用于基因治療的載體分為病毒載體病毒載體和和非病非病毒載體毒載體。病毒載體病毒載體是利用目的基因取代天然病毒某些基因，具有轉(zhuǎn)染率高、基因持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但免疫原性較強(qiáng)，有一定危險(xiǎn)性。非病毒載體非病

13、毒載體是基于DNA的人工復(fù)合物或微粒，它包括裸DNA和脂質(zhì)體包埋DNA等方法，盡管安全性及免疫性問題較少，但是基因轉(zhuǎn)化率低，基因穩(wěn)定性較差，表達(dá)時(shí)間較短。23一個(gè)理想的基因治療載體應(yīng)具備的特征包括一個(gè)理想的基因治療載體應(yīng)具備的特征包括 能靶向性轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞 轉(zhuǎn)染率高 作用的宿主范圍大 包裝容量大 可調(diào)控性表達(dá) 免疫原性弱 容易生產(chǎn)和運(yùn)輸 有一定保質(zhì)期 然而，目前尚無(wú)完全符合上述條件的理想載體系統(tǒng)。由于腫瘤的基因治療需要較高轉(zhuǎn)染率的載體，因此目前仍以病毒載體為主。24用于基因治療的病毒載體用于基因治療的病毒載體病毒載體病毒載體生物學(xué)特性生物學(xué)特性適用范圍適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體 單鏈RNA病毒（8

14、-10 kb)可感染分裂細(xì)胞，整合到染色體中，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，有致癌危險(xiǎn)離體法基因治療、腫瘤基因治療腺病毒載體 雙鏈DNA病毒（36 kb)可感染分裂和非分裂細(xì)胞，不整合到染色體中，外源基因表達(dá)水平高，表達(dá)時(shí)間較短，免疫原性強(qiáng)直接體內(nèi)法基因治療、腫瘤基因治療、疫苗腺病毒相關(guān)載體 單鏈DNA病毒（5kb）可感染分裂和非分裂細(xì)胞，整合到染色體中，無(wú)致病性，免疫原性強(qiáng)，可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因，在骨骼肌，心肌，肝臟，視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高直接體內(nèi)法基因治療、離體法基因治療、遺傳病基因治療、獲得性慢性疾病的基因治療HSV病毒載體 雙鏈DNA病毒（152kb）具有嗜神經(jīng)性，可逆軸突傳遞，可潛伏感染，容量大，可感

15、染分裂和非分裂細(xì)胞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療、腫瘤的基因治療其中腺病毒載體應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域最為廣泛和成熟其中腺病毒載體應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域最為廣泛和成熟25第四節(jié)第四節(jié) 病毒與生物防治病毒與生物防治概念概念：生物防治是指利用有益生物及其代謝產(chǎn)物和基 因產(chǎn)品等控制有害生物的方法。特點(diǎn)特點(diǎn)：具有不污染環(huán)境、對(duì)人和其他生物安全、防治作用比較持久、易于同其他植物保護(hù)措施協(xié)調(diào)配合并能節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物病蟲害和雜草綜合治理中的一項(xiàng)重要措施。用途用途：除害蟲天敵外，許多昆蟲病原微生物已廣泛應(yīng)用于害蟲生物防治中，包括特異性感染昆蟲的病原真菌、細(xì)菌與病毒。同時(shí)，人們也一直在開發(fā)昆蟲病毒進(jìn)行害蟲的防治，其中殺

16、蟲專一性極強(qiáng)的桿狀病毒是很有發(fā)展前途的生物農(nóng)藥。26（一）桿狀病毒簡(jiǎn)介（一）桿狀病毒簡(jiǎn)介 桿狀病毒是基因組大小為90-180kb的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，主要感染鱗翅目昆蟲。 桿狀病毒作為生物殺蟲劑，其顯著優(yōu)點(diǎn)是流行性和持久性，一年使用可多年收益，不破壞生態(tài)平衡，但它潛伏期長(zhǎng)、殺蟲譜窄。 目前已有大量桿狀病毒被用于防治果樹、棉花、蔬菜和大豆等作物上的害蟲。我國(guó)使用棉鈴蟲核型多角體病毒大面積防治棉鈴蟲，取得了很好的防治效果。27（二）基因工程改造桿狀病毒（二）基因工程改造桿狀病毒 野生型桿狀病毒殺蟲譜窄、殺蟲速度慢、時(shí)間長(zhǎng)，施用后4-14天才表現(xiàn)出殺蟲活性。與化學(xué)農(nóng)藥接觸致死不同的是，桿狀病毒殺蟲劑

17、只有當(dāng)昆蟲進(jìn)食足夠量的病毒粒子，通過病毒的復(fù)制增殖來(lái)破壞昆蟲組織和器官之后才能起到殺蟲作用。 它與桿狀病毒的施用率、穩(wěn)定性，靶標(biāo)害蟲的生理、遺傳特性及害蟲群體組成高度相關(guān)。因此利用基因工程手段改造野生型病毒，使重組后基因工程病毒殺蟲劑更具有實(shí)用價(jià)值。 目前主要從3個(gè)方面進(jìn)行基因改造：一 是通過修飾或去除 與宿主范圍相關(guān)的基因來(lái)拓寬病毒的殺蟲譜；二 是插入某些昆蟲選擇性毒素基因以提高殺蟲速度；三 是通過缺失某些非必需基因來(lái)增加殺蟲效果。28桿狀病毒殺蟲譜的改造桿狀病毒殺蟲譜的改造 桿狀病毒的專一性決定其狹窄的宿主范圍，許多NPV僅能感染單一昆蟲種類。而廣譜病毒不僅可以克服桿狀病毒殺蟲專一的缺點(diǎn)，

18、用同一種病毒殺幾種主要害蟲，因此在病毒生物防治中具有重要地位。篩選和構(gòu)建宿主范圍擴(kuò)大的桿狀病毒依然是改進(jìn)病毒殺蟲劑所需考慮的重要因素。 桿狀病毒對(duì)靶昆蟲的感染力弱并非由于病毒不能進(jìn)入，而是因?yàn)闂U狀病毒在非靶組織中復(fù)制能力的缺陷造成的，即在非靶細(xì)胞中病毒DNA的復(fù)制、表達(dá)在不同時(shí)期被阻斷。 隨著病毒宿主與分子基礎(chǔ)研究的深入，完全有可能研究出殺蟲譜擴(kuò)大到多種害蟲的基因工程病毒。29在桿狀病毒基因組中插入外源基因在桿狀病毒基因組中插入外源基因提高殺蟲速度提高殺蟲速度 將特定的外源基因用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)入桿狀病毒基因組中獲得重組病毒，可用來(lái)提高殺蟲速度，是目前構(gòu)建重組病毒殺蟲劑的主要研究途徑。 隨著分

19、子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種昆蟲病毒全基因組序列的測(cè)定及對(duì)昆蟲桿狀病毒結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的逐步認(rèn)識(shí)，為開展昆蟲桿狀病毒基因工程殺蟲劑的研究提供了良好基礎(chǔ)。例如：表達(dá)蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白的重組病毒；表達(dá)昆蟲特異性神經(jīng)毒素的重組病毒；表達(dá)昆蟲病毒增效蛋白基因。30去除病毒非必需基因增加殺蟲效果去除病毒非必需基因增加殺蟲效果 桿狀病毒的基因組中存在某些與病毒桿狀病毒的基因組中存在某些與病毒DNA復(fù)制無(wú)關(guān)的非必需基因，通過對(duì)這些非必復(fù)制無(wú)關(guān)的非必需基因，通過對(duì)這些非必需基因的缺失，有可能提高桿狀病毒的殺需基因的缺失，有可能提高桿狀病毒的殺蟲活性。蟲活性。31（三）基因工程病毒殺蟲劑的生物安（三）基因工程病毒殺蟲劑的生物安全性全性 最近發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒雖然不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和繁殖，但是其病毒粒子可以通過病毒囊膜與哺乳