ELISA實(shí)驗(yàn)-PPT

1、L o g oL o g oPowerPoint TL o g oL o g o目錄目錄ELISA簡(jiǎn)介ELISA原理相關(guān)儀器試劑實(shí)驗(yàn)步驟L o g oL o g oELISA簡(jiǎn)介酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA，它是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法。 酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過(guò)所有人造催化劑，ELISA 就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。使用酶去標(biāo)記抗原或抗體以后，既不影響抗原抗體反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。因此ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀

2、標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)療檢測(cè)以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。L o g oL o g oELISA原理1.抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，并保持器免疫學(xué)活性。例如：蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與聚苯乙烯表面的疏水基團(tuán)能產(chǎn)生互作用而吸附。2.抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；3.酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，由此進(jìn)行定性或定量分析。L o g oL o g o顯現(xiàn)微量的免顯現(xiàn)微

3、量的免疫沉淀反應(yīng)疫沉淀反應(yīng)-免疫酶染色各免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。的定位。研究抗酶抗體研究抗酶抗體的合成的合成-定量檢測(cè)體液定量檢測(cè)體液中抗原或抗體中抗原或抗體成份成份Elisa的應(yīng)用L o g oL o g oELISA類(lèi)別ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法，主要類(lèi)型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。L o g oL o g o雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，先將已知抗體連接在固相載體上，待測(cè)抗原與抗體結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，

4、復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體原成正比。競(jìng)爭(zhēng)法 當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。雙抗原夾心法 雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類(lèi)似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。間接法 間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。L o g oL o g o 除了以上常見(jiàn)的4種檢測(cè)方法外，還有直接法、捕獲包被法、競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)抗體）、ABS-ELISA法等其他方法。L o g oL

5、o g oELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要分以下三步：第一：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.了解將要測(cè)定的樣品屬于什么類(lèi)別，選用最佳的ELISA檢測(cè)方法；2.選用正確的陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品、樣品標(biāo)準(zhǔn)品等；3.規(guī)劃實(shí)驗(yàn)中所使用各種試劑的濃度、加入量、反應(yīng)時(shí)間等；4.再細(xì)化實(shí)驗(yàn)中每個(gè)步驟的開(kāi)展時(shí)間，合理的時(shí)間安排能使實(shí)驗(yàn)有條不絮的進(jìn)行。第二：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1.實(shí)驗(yàn)所使用物料的清點(diǎn)；2.實(shí)驗(yàn)試劑的配備；3.實(shí)驗(yàn)儀器的預(yù)約；L o g oL o g o第三：實(shí)驗(yàn)操作（以雙抗體夾心法為例）1. 包被（在聚苯乙烯板上包被特異性已知抗體，使之與板結(jié)合） 4過(guò)夜（大于12小時(shí)）或37孵育 2小時(shí)，包被后洗滌一次；2. 封閉（一般使用0.12%

6、BSA，5%脫脂奶粉，1%明膠，10%小牛血清等）37反應(yīng)2小時(shí)（封閉 液體積要大于包被液體積），封閉后清洗3次；3. 加入含有待測(cè)抗原的樣品，37孵育1小時(shí)；4. 洗滌，清洗3次；5. 加入酶標(biāo)液（酶標(biāo)二抗），37孵育1小時(shí)；6. 洗滌，清洗5次；7. 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)（37避光顯色515min)，終止顯色后測(cè)量450/630nm吸光值。 注：上面實(shí)驗(yàn)共12次清洗，清洗次數(shù)可適當(dāng)增多，同一反應(yīng)盡量保證使用同一種清洗液，常見(jiàn)清洗液有PBST、TBST、PBS等。L o g oL o g o結(jié)果判定定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在

7、這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。待測(cè)孔（P）與對(duì)照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽(yáng)性，N為陰性對(duì)照孔。定量測(cè)定L o g oL o g o實(shí)驗(yàn)中使用的試劑、儀器常用試劑：1. 包被緩沖液：0.05M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、0.1M PH 9.6 碳酸鹽緩沖液、pH7.2 的磷酸鹽緩沖液及pH78的Tris-HCL 緩沖液等。2. 封閉液：0.12%BSA，5%脫脂奶粉，1%明

8、膠，10%小牛血清等（一般溶于0.15M PBS中）。3. 洗滌液：PBS、PBST、TBST等。4. 抗體稀釋液：PBST、0.52%BSA（溶于PBST中）等。5. 底物緩沖液：TMB顯色液、OPD顯色液、ABTS顯色液、AP顯色液等，根據(jù)所使用的酶標(biāo)抗體選用對(duì)應(yīng)的底物緩沖液顯色。6. 終止液：2M硫酸。L o g oL o g o常見(jiàn)儀器單孔道、多孔道移液器振蕩器洗板機(jī)酶標(biāo)儀計(jì)時(shí)器L o g oL o g o實(shí)驗(yàn)中遇到常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法L o g oL o g o1.陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果：造成該現(xiàn)象的原因有4個(gè)：1）試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現(xiàn)交叉污染。 應(yīng)當(dāng)更換使用試

9、劑，小心操作；2）酶標(biāo)板洗板不徹底。 嘗試用洗液充滿(mǎn)板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈；3）抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異結(jié)合。 應(yīng)該根據(jù)推薦用量使用抗體，盡量使用較少的抗體；4）夾心法、捕獲法中檢測(cè)抗體與包被抗體/抗原反應(yīng)。 確定使用的是正確的包被抗體和檢測(cè)抗體，兩者之間不會(huì)互相反應(yīng)。L o g oL o g o2.酶標(biāo)板整體背景高造成該現(xiàn)象的原因有4個(gè)：1）抗體非特異性結(jié)合。 應(yīng)確保進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液，最好使用5%10%的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清，確保板孔經(jīng)過(guò)預(yù)處理以防止非特異結(jié)合，使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，最好經(jīng)過(guò)了預(yù)吸收處理；2）底物結(jié)合濃度過(guò)高

10、或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。 應(yīng)調(diào)整底物的濃度，當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時(shí)間；3）底物溶液不新鮮或被污染。 應(yīng)檢測(cè)底物溶液，正常的底物溶液應(yīng)該是清亮透明的，如果變黃或其他顏色則是被污染的標(biāo)志；4）底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光。 底物孵育應(yīng)該在避光環(huán)境下進(jìn)行。L o g oL o g o3.吸光度數(shù)值偏高或偏低造成的該現(xiàn)象的原因有幾個(gè)：1）樣品中待檢抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果偏低。 可嘗試增加樣品的使用量或者更換一個(gè)檢測(cè)更靈敏的方法；2）加入抗體量不合適也會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高 應(yīng)確定使用的是建議抗體用量，或者為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量；3）孵育時(shí)間不夠長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致

11、檢測(cè)結(jié)果偏低。 應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間，確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合；4）孵育溫度不適合。 應(yīng)保證抗體在最適宜并且穩(wěn)定的溫度下孵育，一般是室溫（25孵育2h或37孵育1h）。L o g oL o g o影響因素的分析L o g oL o g o1.標(biāo)本的影響1.1 溶血標(biāo)本及混有紅細(xì)胞的血清采用ELISA法檢測(cè)易產(chǎn)生假陽(yáng)性 可能是溶血血清中含有過(guò)氧化酶物質(zhì)（紅細(xì)胞或血紅蛋白中的亞鐵血紅素），在洗滌過(guò)程中往往難以完全洗脫，它可使H2O2釋放出原生態(tài)氧(O)，從而催化底物四甲基聯(lián)苯胺生成可溶性的有色物質(zhì)，即顯藍(lán)色，產(chǎn)生假陽(yáng)性。所以嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。1.2 標(biāo)本受細(xì)菌污染 ：因菌體中可能

12、含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，因此，被細(xì)菌污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。1.3 標(biāo)本保存不當(dāng) ：在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、造成假陽(yáng)性；為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。L o g oL o g o1.4 塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD

13、值，EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性。1.5 標(biāo)本凝固不全在工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；因此血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清。2.試劑影響 ELISA檢測(cè)試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之。3.操作技術(shù)的影響3.1 吸量的準(zhǔn)確性 :吸量不準(zhǔn)確，直接影響檢測(cè)結(jié)果。因此加樣器也要經(jīng)常清洗，

14、定期校準(zhǔn)。L o g oL o g o3.2 溫浴影響 :抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周?chē)c內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。3.3 加樣次序影響 :有時(shí)我們?cè)诩訕舆^(guò)程中，常常會(huì)遇到個(gè)別標(biāo)本未離心等情況，為了節(jié)約時(shí)間，往往這時(shí)我們會(huì)先加酶結(jié)合物，然后等標(biāo)本分離好后再加標(biāo)本，這樣，竟常常會(huì)造成HBeAb和HBcAb的假陰性。因?yàn)镠BeAb和HBcAb都是競(jìng)爭(zhēng)抑制法，先加入酶標(biāo)記的抗體，首先與固相載體上的抗原結(jié)合，待加入顯色劑后，因酶的存在而顯色，故呈陰性。3.4 洗滌方法對(duì)結(jié)果的影響 :洗滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，全自動(dòng)洗板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔處于阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽(yáng)性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過(guò)程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清洗幾遍。L o g oL o g o4.干擾物質(zhì)的影響4.1有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中