生物工程制藥之酶工程制藥8

1、生物制藥工藝生物制藥工藝（酶工程制藥酶工程制藥） 酶酶工程（工程（Enzyme engineering）是酶學(xué)和工程是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透而發(fā)展的一門新的技術(shù)科學(xué)。固定學(xué)相互滲透而發(fā)展的一門新的技術(shù)科學(xué)。固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指用物理或化學(xué)方法處理，使酶變體來說，是指用物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑，屬于修飾酶。制備固定化催化作用的酶制劑，屬于修飾酶。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。酶的過程稱為酶的固定化。4.1固定化酶的特點(diǎn)：固

2、定化酶的特點(diǎn)：具有生物催化劑的功能，又具有固相催化劑的特性。具有生物催化劑的功能，又具有固相催化劑的特性。1、可以在較長時間內(nèi)多次使用，固定化后一般酶的穩(wěn)定性、可以在較長時間內(nèi)多次使用，固定化后一般酶的穩(wěn)定性提高；提高；2、酶與底物和產(chǎn)物容易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化；、酶與底物和產(chǎn)物容易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化；3、反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；、反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；4、酶的利用效率高，單位酶催化底物量增加，用酶量減少；、酶的利用效率高，單位酶催化底物量增加，用酶量減少； 4.1固定化酶的特點(diǎn)：固定化酶的特點(diǎn)：存在的一些缺點(diǎn)：存在的一些

3、缺點(diǎn)：1、固定化時，酶活力損失；、固定化時，酶活力損失；2、增加生產(chǎn)的成本，初始投資大；、增加生產(chǎn)的成本，初始投資大；3、只能用于可溶性底物，、只能用于可溶性底物，較適合于小分子底物，對大分子較適合于小分子底物，對大分子底物不適宜；底物不適宜；4、胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離純化過程；、胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離純化過程；4.2.酶的固定化方法與制備技術(shù)酶的固定化方法與制備技術(shù)主要有主要有載體結(jié)合法、載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法包埋法、交聯(lián)法4.2.14.2.1載體結(jié)合法載體結(jié)合法即將酶結(jié)合到不溶性載體上的一種固定方法，可以分為：即將酶結(jié)合到不溶性載體上的一種固定方法，可以分為：1）物理吸附法）物理吸附法

4、2）離子結(jié)合法）離子結(jié)合法3）共價結(jié)合（偶聯(lián)）法）共價結(jié)合（偶聯(lián)）法物理吸附法物理吸附法離子結(jié)合法離子結(jié)合法共價結(jié)合法共價結(jié)合法4.2.1.1.物理吸附法物理吸附法(physical adsorption) 是用物理的方法將酶吸附于不溶性的載體上的一種方法，主要是是用物理的方法將酶吸附于不溶性的載體上的一種方法，主要是通過氫鍵、疏水鍵等作用力。通過氫鍵、疏水鍵等作用力。1 1）無機(jī)吸附無機(jī)吸附載體載體：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化鋁、：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化鋁、硅膠、磷酸鈣、高嶺土、皂土金屬氧化物等；硅膠、磷酸鈣、高嶺土、皂土金屬氧化物等；2 2）有機(jī)吸附載體有機(jī)吸附載體：纖維素

5、、膠原以及火棉膠等纖維素、膠原以及火棉膠等；3 3）天然高分子載體天然高分子載體：淀粉、谷蛋白等。：淀粉、谷蛋白等。 影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素: :1.pH：影響載體和酶電荷變化，從而影響酶吸附，通常等電點(diǎn)吸附量最大。：影響載體和酶電荷變化，從而影響酶吸附，通常等電點(diǎn)吸附量最大。2.離子強(qiáng)度：一般認(rèn)為鹽阻止吸附，即低離子強(qiáng)度下吸附增強(qiáng)。離子強(qiáng)度：一般認(rèn)為鹽阻止吸附，即低離子強(qiáng)度下吸附增強(qiáng)。3. 酶濃度：若吸附劑的量固定，隨酶濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。酶濃度：若吸附劑的量固定，隨酶濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4. 溫度：酶往往是隨溫度上升而吸

6、附增強(qiáng)，但影響酶活。溫度：酶往往是隨溫度上升而吸附增強(qiáng)，但影響酶活。5. 吸附速度：酶在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。吸附速度：酶在固體載體上的吸附速度要比小分子慢得多。 6. 載體：對于多孔性載體，則顆粒越小，比表面積大，吸附力越強(qiáng)。載體：對于多孔性載體，則顆粒越小，比表面積大，吸附力越強(qiáng)。吸附法的優(yōu)點(diǎn)吸附法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達(dá)到純化和固化的目的，所得固定化酶使用失活后可以重新同時達(dá)到純化和固化的目的，所得固定化酶使用失活后可以重新活化和再生?；罨驮偕Ｎ椒ǖ娜秉c(diǎn)吸附法的缺點(diǎn)：酶和載體的結(jié)合力不強(qiáng)，易

7、脫落，會導(dǎo)致催化活：酶和載體的結(jié)合力不強(qiáng)，易脫落，會導(dǎo)致催化活力的喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。力的喪失和沾污反應(yīng)產(chǎn)物。 世界第一例獲得工業(yè)應(yīng)用的固定化酶是世界第一例獲得工業(yè)應(yīng)用的固定化酶是 DEAE-Sephadex A-25吸附的氨基酰化酶反應(yīng)用于吸附的氨基?；阜磻?yīng)用于 DL-AA的光學(xué)分析。的光學(xué)分析。4.2.1.2.離子結(jié)合法離子結(jié)合法(ion binding) 是指在適宜的是指在適宜的pH和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈和離子強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基間的相互作用而達(dá)到酶固定化的解離基團(tuán)和離子交換基間的相互作用而達(dá)到酶固定化的方法（離子鍵）。方法（離子鍵）。 最常用的交換劑有

8、最常用的交換劑有CM-纖維素、纖維素、DEAE-纖維素、纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如樹脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。等。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑。4.2.1.34.2.1.3共價結(jié)合（偶聯(lián)）法共價結(jié)合（偶聯(lián)）法 共價結(jié)合（偶聯(lián)）法是目前研究中最為活躍的方法。它的原理共價結(jié)合（偶聯(lián)）法是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是酶蛋白分子上的非功能基團(tuán)和是酶蛋白分子上的非功能基團(tuán)和固相支持物固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形

9、成共價鍵，因而將酶固定在支持物上（借助共價鍵將酶的非活性形成共價鍵，因而將酶固定在支持物上（借助共價鍵將酶的非活性必需側(cè)鏈基團(tuán)和必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)）。）。 影響共價結(jié)合（偶聯(lián)）法中的因素影響共價結(jié)合（偶聯(lián)）法中的因素（ 1 ）要求）要求載體載體親水，并且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和親水，并且有一定的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性穩(wěn)定性，同時具備，同時具備在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)。在溫和條件下與酶結(jié)合的功能基團(tuán)。（ 2 ）偶聯(lián)反應(yīng)的）偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)條件反應(yīng)條件必須在必須在溫和溫和pH、中等離子強(qiáng)度和低溫的、中等離子強(qiáng)度和低溫的緩沖溶液中。緩沖溶液中。（ 3 ）所選擇的偶聯(lián)反

10、應(yīng)要盡量考慮到對酶的其它功能基團(tuán)）所選擇的偶聯(lián)反應(yīng)要盡量考慮到對酶的其它功能基團(tuán)副反應(yīng)副反應(yīng)盡可能盡可能少少。（ 4 ）要考慮）要考慮酶固定化后的構(gòu)型酶固定化后的構(gòu)型，盡量減少載體的空間位阻對酶活，盡量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。力的影響。（1）偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性）偶聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)：得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。好、利于連續(xù)使用。（2）偶聯(lián)法的缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激）偶聯(lián)法的缺點(diǎn)：載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時共價結(jié)合會影響到酶的空

11、間構(gòu)象，從而對酶的催化同時共價結(jié)合會影響到酶的空間構(gòu)象，從而對酶的催化活性產(chǎn)生影響?；钚援a(chǎn)生影響。4.2.酶的固定化方法與制備技術(shù)酶的固定化方法與制備技術(shù)4.2.24.2.2包埋法包埋法4.2.2.1網(wǎng)格包埋法（凝膠包埋法、膠格包埋法）：網(wǎng)格包埋法（凝膠包埋法、膠格包埋法）： 將酶分子包埋在高聚物網(wǎng)格內(nèi)的包埋將酶分子包埋在高聚物網(wǎng)格內(nèi)的包埋方法。方法。 是最常用的包埋法是最常用的包埋法 ，先把丙烯酰胺單體、交聯(lián)劑與懸，先把丙烯酰胺單體、交聯(lián)劑與懸浮在緩沖溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系統(tǒng)使之開浮在緩沖溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系統(tǒng)使之開始聚合，結(jié)果就在酶分子周圍形成交聯(lián)的高聚物網(wǎng)絡(luò)。它

12、始聚合，結(jié)果就在酶分子周圍形成交聯(lián)的高聚物網(wǎng)絡(luò)。它的機(jī)械強(qiáng)度高，在包埋的同時使酶共價偶聯(lián)到高聚物上，的機(jī)械強(qiáng)度高，在包埋的同時使酶共價偶聯(lián)到高聚物上，可以減少酶的脫落?？梢詼p少酶的脫落。 p海藻酸鈉海藻酸鈉也可以用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，也可以用來作為包埋載體，它從海藻中提取出來，可被多價離子可被多價離子Ca2+、Al3+凝膠化凝膠化 ，操作簡單經(jīng)濟(jì)。，操作簡單經(jīng)濟(jì)。p K-角叉萊膠（卡拉膠）角叉萊膠（卡拉膠）冷卻成膠或與二、三價金屬離子冷卻成膠或與二、三價金屬離子成膠。包埋條件溫和無毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化的酶活回成膠。包埋條件溫和無毒性，機(jī)械強(qiáng)度好。固定化的酶活回收率和穩(wěn)定性都

13、比聚丙烯酰胺法好。收率和穩(wěn)定性都比聚丙烯酰胺法好。p 膠原和明膠膠原和明膠也是常用的包埋載體。也是常用的包埋載體。4.2.2.2微囊法微囊法 主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主主要將酶封裝在膠囊、脂質(zhì)體和中空纖維中。膠囊和脂質(zhì)體主要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用要用于醫(yī)學(xué)治療，中空纖維主要適于工業(yè)使用 。微囊制備方法：微囊制備方法：l 界面沉淀法界面沉淀法是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。相和有機(jī)相的界面上溶解度較低而形成的皮膜將酶包埋。l 界面聚合法界面

14、聚合法是用化學(xué)手段制備微囊的方法。所得的微囊外觀好，但是用化學(xué)手段制備微囊的方法。所得的微囊外觀好，但不穩(wěn)定，有些酶還會因在包埋過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失活。不穩(wěn)定，有些酶還會因在包埋過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失活。l 乳化液膜包埋法乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性劑使之乳化形成液膜達(dá)是在水溶液中添加表面活性劑使之乳化形成液膜達(dá)到包埋目的的一種方法。到包埋目的的一種方法。 包埋法的優(yōu)點(diǎn)包埋法的優(yōu)點(diǎn)在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但又相對牢固的酶固定化方法。結(jié)構(gòu)但又相對牢固的酶固定化方法。包埋法的缺點(diǎn)包埋法的缺點(diǎn)是只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物是只有小

15、分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴(kuò)散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。網(wǎng)架擴(kuò)散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網(wǎng)架會對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致這是由于高聚物網(wǎng)架會對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散阻力導(dǎo)致固定化酶動力學(xué)行為改變，使活力降低。固定化酶動力學(xué)行為改變，使活力降低。4.2.酶的固定化方法與制備技術(shù)酶的固定化方法與制備技術(shù)4.2.34.2.3交聯(lián)法交聯(lián)法 共價交聯(lián)法的基本原理是酶分子和多功能試劑之間共價交聯(lián)法的基本原理是酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成共價鍵得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)v 交聯(lián)法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子交聯(lián)法是利用雙

16、功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，把酶蛋與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的固定化酶。白分子彼此交叉連接起來，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的固定化酶。v 能起交聯(lián)作用的試劑很多，但目前常用的交聯(lián)試劑是戊能起交聯(lián)作用的試劑很多，但目前常用的交聯(lián)試劑是戊二醛和雙重氮聯(lián)苯胺二醛和雙重氮聯(lián)苯胺-2,2-二磺酸。交聯(lián)法常與吸附法結(jié)二磺酸。交聯(lián)法常與吸附法結(jié)合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結(jié)合于合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結(jié)合于載體上。載體上。交聯(lián)法的四種形式：交聯(lián)法的四種形式：（1）酶直接交聯(lián)法（交聯(lián)酶法

17、）：）酶直接交聯(lián)法（交聯(lián)酶法）： 在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液物。固定化依賴于酶與試劑的濃度、溶液pH和離子強(qiáng)度、和離子強(qiáng)度、溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。溫度和反應(yīng)時間之間的平衡。 操作簡單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。操作簡單，但是缺乏選擇性，活力回收往往不高。（ 2 ）酶輔助蛋白交聯(lián)：）酶輔助蛋白交聯(lián)： 如如可得酶量有限，可以使用第二個可得酶量有限，可以使用第二個“載體載體”蛋白來增蛋白來增加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。這種加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。這

18、種“載體載體”蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。白等。（3 3）吸附交聯(lián)法：）吸附交聯(lián)法： 此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹此法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其它大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試脂或其它大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶殼狀固定化酶。（4 4）載體交聯(lián)法：）載體交聯(lián)法： 用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，用多功能試劑的一部分功能基團(tuán)化學(xué)修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋

19、白。而其中的另一部分功能基團(tuán)偶聯(lián)酶蛋白。物理吸附包埋法共價結(jié)合法共價交聯(lián)法制備易易難難結(jié)合力弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中底物專一性無變化無變化有變化有變化再生可能不可能不可能不可能固定化費(fèi)用低中高中幾種固定化酶制備方法的特點(diǎn)小結(jié)幾種固定化酶制備方法的特點(diǎn)小結(jié)4.34.3固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 固定化細(xì)胞是指直接將細(xì)胞固定在水不溶性載體上，固定化細(xì)胞是指直接將細(xì)胞固定在水不溶性載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動（生長、繁殖和新陳在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動（生長、繁殖和新陳代謝）的細(xì)胞。代謝）的細(xì)胞。 固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)： 1 1、可增殖，細(xì)胞密度大，可獲得高度密集而體、可增殖，細(xì)

20、胞密度大，可獲得高度密集而體 積小的生產(chǎn)菌集合體。積小的生產(chǎn)菌集合體。 2 2、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時間反復(fù)使用或、發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時間反復(fù)使用或 連續(xù)使用。連續(xù)使用。 3 3、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。、發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化。 4 4、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)。、有利于需要輔酶和多酶系統(tǒng)才能進(jìn)行的反應(yīng)。4.3.24.3.2固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞方法與制備技術(shù)方法與制備技術(shù)主要有主要有載體結(jié)合法載體結(jié)合法、包埋法包埋法、交聯(lián)法交聯(lián)法和和無載體法無載體法（p226） 包埋法是細(xì)胞固定化中最常用的方法，常用的載體有卡包埋法是細(xì)胞固定化中最常用的方

21、法，常用的載體有卡拉膠、瓊脂、明膠、海藻膠、聚乙烯醇等。拉膠、瓊脂、明膠、海藻膠、聚乙烯醇等。 無載體法：靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的方無載體法：靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的方法，通過法，通過助凝劑助凝劑（如脫乙酰甲殼素）或（如脫乙酰甲殼素）或選擇性熱變性選擇性熱變性的方法的方法實(shí)現(xiàn)固定化。可獲得高密度的細(xì)胞，固定化條件溫和，缺點(diǎn)實(shí)現(xiàn)固定化。可獲得高密度的細(xì)胞，固定化條件溫和，缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度差。是機(jī)械強(qiáng)度差。4.4 4.4 影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素 酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的

22、變化，二是受固定化兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：影響效應(yīng)： 分配效應(yīng)分配效應(yīng) 空間障礙效應(yīng)空間障礙效應(yīng) 擴(kuò)散限制效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)4.4.14.4.1、分配效應(yīng)、分配效應(yīng) 由于載體和底物的由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。由這種不同造

23、成環(huán)境。由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個環(huán)境之間的應(yīng)物在兩個環(huán)境之間的分配不同，被稱為分配不同，被稱為分配分配效應(yīng)效應(yīng)。4.4.24.4.2、空間障礙效應(yīng)空間障礙效應(yīng) 固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制( (因因?yàn)檩d體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給為載體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障酶的活性部位造成了空間屏障) )，使酶分子的活性基，使酶分子的活性基團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶的分子活性中心團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶的分子活性中心對底物的定位作用對底物的定位作用,

24、,所造成的對固定化酶的活力的影所造成的對固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)空間障礙效應(yīng)。4.4.34.4.3、擴(kuò)散限制效應(yīng)、擴(kuò)散限制效應(yīng) 酶固定化使生物催化反應(yīng)從酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力，分為外、內(nèi)擴(kuò)散阻力：生了擴(kuò)散阻力，分為外、內(nèi)擴(kuò)散阻力： 1 1）外擴(kuò)散阻力外擴(kuò)散阻力是底物從是底物從宏觀環(huán)境宏觀環(huán)境向向酶顆粒表面酶顆粒表面?zhèn)鬟f傳遞過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，發(fā)生在反應(yīng)之前，存在于固過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，發(fā)生在反應(yīng)之前，存在于固定化顆粒周圍的液膜層。定化顆粒周圍的液膜層。 它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通

25、過增加攪它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。 2 2）內(nèi)擴(kuò)散阻力內(nèi)擴(kuò)散阻力是指是指底物分子底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞達(dá)到固相酶表面后傳遞到到酶活性部位酶活性部位時的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時進(jìn)行。時的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時進(jìn)行。 載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的主要原因。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的主要原因。因此使用低分子量底物，小粒徑、載體孔盡可能大而且因此使用低分子量底物，小粒徑、載體孔盡可能大而且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種互相連通，或僅僅將酶固定在

26、載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。內(nèi)擴(kuò)散阻力。4.54.5固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變4.5.14.5.1、固定化酶的、固定化酶的活力活力在大多數(shù)情況下比天然酶下降，在大多數(shù)情況下比天然酶下降，其其專一性專一性也會受影響發(fā)生改變。也會受影響發(fā)生改變。 活力下降的原因：活力下降的原因： 酶分子在固定化過程中，酶的空間構(gòu)象變化，酶分子在固定化過程中，酶的空間構(gòu)象變化， 甚至活性中心的氨基酸也會參加反應(yīng)。甚至活性中心的氨基酸也會參加反應(yīng)。 固定化后的空間障礙效應(yīng)的影響。固定化后的空間障礙效應(yīng)的影響。 內(nèi)擴(kuò)散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻。內(nèi)擴(kuò)散阻力的影響使底物分子與

27、活性中心的接近受阻。 包埋法時被高分子物質(zhì)半透膜包圍。包埋法時被高分子物質(zhì)半透膜包圍。4.54.5固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變4.5.4.5.2 2、固定化后酶、固定化后酶穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高 穩(wěn)定性提高的原因：穩(wěn)定性提高的原因： 固定化后的酶與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子固定化后的酶與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子 伸展變形。伸展變形。 酶活力的緩慢釋放。反應(yīng)開始只有部分酶起作酶活力的緩慢釋放。反應(yīng)開始只有部分酶起作 用，其余部分在開始起作用的酶變性后才起用，其余部分在開始起作用的酶變性后才起 作用。作用。 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。4.54.

28、5固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變4.5.4.5.3 3、固定化酶（細(xì)胞）的、固定化酶（細(xì)胞）的最適最適pHpH變化變化 酶固定化后，對底物的最適酶固定化后，對底物的最適pH曲線常常發(fā)生偏移。曲線常常發(fā)生偏移。 一般來說，一般來說，帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值較游離酶偏高值較游離酶偏高，即，即堿性偏移堿性偏移。反之，。反之，若使用帶正電荷的若使用帶正電荷的載體，其最適載體，其最適pH值較游離酶偏低值較游離酶偏低，即向，即向酸性偏移酸性偏移。4.54.5固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變4.5.4.5.4 4、固

29、定化酶（細(xì)胞）的、固定化酶（細(xì)胞）的最適溫度最適溫度的變化的變化 酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。因?yàn)楣潭ɑ?，酶的熱穩(wěn)定性度的綜合結(jié)果。因?yàn)楣潭ɑ?，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是有利于提高，所以最適溫度也隨之提高，這是有利于酶反應(yīng)的結(jié)果。酶反應(yīng)的結(jié)果。4.54.5固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變4.5.54.5.5、米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的變化的變化 固定化酶的米氏常數(shù)固定化酶的米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。隨載體的帶電性能變化。 由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響

30、引起酶與底物親和力變化，從而使力變化，從而使Km變化。而這種變化。而這種Km變化又受到溶液中變化又受到溶液中離子強(qiáng)度影響：離子強(qiáng)度升高，載體周圍的靜電梯度離子強(qiáng)度影響：離子強(qiáng)度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。變化也逐漸縮小以至消失。4.6 4.6 固定化酶（細(xì)胞）固定化酶（細(xì)胞）的活力的活力 固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可以用在一定條件下它所催學(xué)反應(yīng)的能力。其大小可以用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速度來表示。 它的單位可定義為每毫克干重固定化

31、酶每分鐘它的單位可定義為每毫克干重固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化底物的量：轉(zhuǎn)化底物的量： 用用mol/ min mg 或或molmin-1/cm 2 4.6.1活力測定方法分為：活力測定方法分為： 間歇測定：在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，在與溶液間歇測定：在攪拌或振蕩反應(yīng)器中，在與溶液酶同樣測定條件下進(jìn)行，然后間隔一定時間取樣，酶同樣測定條件下進(jìn)行，然后間隔一定時間取樣，過濾后按常規(guī)進(jìn)行測定。過濾后按常規(guī)進(jìn)行測定。 連續(xù)測定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱連續(xù)測定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液，根據(jù)中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液，根據(jù)流速流速和和反應(yīng)速度反應(yīng)速度之間

32、關(guān)系，算出酶活力。之間關(guān)系，算出酶活力。4.6 4.6 固定化酶（細(xì)胞）固定化酶（細(xì)胞）的活力的活力4.6.2固定化酶的活力回收固定化酶的活力回收活力回收活力回收= 100%100%4.6.34.6.3固定化酶（細(xì)胞）的半衰期固定化酶（細(xì)胞）的半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶的活力下降為最初在連續(xù)測定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間稱為固定化酶的半衰期。活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間稱為固定化酶的半衰期。以以t t1/21/2表示。表示。 固定化酶的操作穩(wěn)定性是影響使用的關(guān)鍵因素，半固定化酶的操作穩(wěn)定性是影響使用的關(guān)鍵因素，半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。衰期是衡量穩(wěn)定性

33、的指標(biāo)。被固定游離酶總活力固定化酶總活力4.74.7固定化酶反應(yīng)器固定化酶反應(yīng)器4.7.1批量式攪拌桶式反應(yīng)器批量式攪拌桶式反應(yīng)器Batch Stirred tank reactor ,BSTR 結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊設(shè)備，適于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。當(dāng)結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊設(shè)備，適于小規(guī)模實(shí)驗(yàn)。當(dāng)前食品和飲料工業(yè)有采用這種形式反應(yīng)器。前食品和飲料工業(yè)有采用這種形式反應(yīng)器。一般應(yīng)用溶一般應(yīng)用溶液酶或粗酶制劑催化液酶或粗酶制劑催化，酶不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化至一定程，酶不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化至一定程度后，通過加熱或其他方法直接使之失效除去。但在反度后，通過加熱或其他方法直接使之失效除去。但在反復(fù)過濾或離心回收過程中，易造

34、成酶的失效損失。工業(yè)復(fù)過濾或離心回收過程中，易造成酶的失效損失。工業(yè)上很少用上很少用.4.7.2連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器Continuous Stirred tank reactor,CSTR 催化劑采用顆粒狀的固定化酶，少數(shù)應(yīng)用片狀固定催化劑采用顆粒狀的固定化酶，少數(shù)應(yīng)用片狀固定化酶。運(yùn)轉(zhuǎn)過程中要不斷分出部分反應(yīng)液，同時補(bǔ)充等化酶。運(yùn)轉(zhuǎn)過程中要不斷分出部分反應(yīng)液，同時補(bǔ)充等量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應(yīng)液流失，所以在量的新鮮底物溶液，為不致使酶隨反應(yīng)液流失，所以在它的出口處通常有濾膜。它的出口處通常有濾膜。利于有底物抑制場合利于有底物抑制場合. .4.7.3連續(xù)攪拌桶式超

35、濾反應(yīng)器連續(xù)攪拌桶式超濾反應(yīng)器 CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR 由連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和超濾裝置組合而由連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器和超濾裝置組合而成成，為小分子量產(chǎn)物與高分子底物的分離、底物，為小分子量產(chǎn)物與高分子底物的分離、底物較徹底的轉(zhuǎn)化以及溶液酶或固定化酶的反復(fù)使用較徹底的轉(zhuǎn)化以及溶液酶或固定化酶的反復(fù)使用提供了可能。但酶易因循環(huán)超濾而失效損失。提供了可能。但酶易因循環(huán)超濾而失效損失。4.7.4填充式反應(yīng)器填充式反應(yīng)器Plug Flow reactor,PFR 床內(nèi)用顆粒狀或片狀固定化酶填充，運(yùn)轉(zhuǎn)時，床內(nèi)用顆粒狀或片狀固定化酶填充，運(yùn)轉(zhuǎn)時，底物按一定方向

36、以恒定速度通過反應(yīng)床。底物按一定方向以恒定速度通過反應(yīng)床。使用最使用最普遍普遍. .4.7.5流動床反應(yīng)器流動床反應(yīng)器Fluidized bed reactor,FBRFluidized bed reactor,FBR 底物溶液以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，底物溶液以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)。混合程度高，故傳熱、傳質(zhì)使固體顆粒處于流化狀態(tài)。混合程度高，故傳熱、傳質(zhì)情況良好。可用于處理粘性強(qiáng)和含有固體顆粒的底物，情況良好?？捎糜谔幚碚承詮?qiáng)和含有固體顆粒的底物，或用于需要供應(yīng)氣體或排放氣體的反應(yīng)。或用于需要供應(yīng)氣體或排放氣體的反應(yīng)。4.7.6循環(huán)流式反應(yīng)器循環(huán)

37、流式反應(yīng)器Recycle reactor,RCRRecycle reactor,RCR 把部分流出物與加料流混合，然后再令其進(jìn)把部分流出物與加料流混合，然后再令其進(jìn)入反應(yīng)器。特點(diǎn)是可以提高液體的流速和減少底入反應(yīng)器。特點(diǎn)是可以提高液體的流速和減少底物向固定化酶表面?zhèn)鬟f的阻力。物向固定化酶表面?zhèn)鬟f的阻力。4.8固定化酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)固定化酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)固定化酶的形狀固定化酶的形狀底物的物理性質(zhì)底物的物理性質(zhì)酶反應(yīng)動力學(xué)特性酶反應(yīng)動力學(xué)特性酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用4.8.14.8.1固定化酶的形狀固定化酶的形狀一般言之，顆粒狀或片狀固定化酶對一般言之，顆粒

38、狀或片狀固定化酶對連續(xù)流攪拌桶連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器式反應(yīng)器和和填充式反應(yīng)器填充式反應(yīng)器類型的反應(yīng)器均可適用。但類型的反應(yīng)器均可適用。但膜狀和纖維狀的固定化酶則不適于膜狀和纖維狀的固定化酶則不適于連續(xù)流攪拌桶式反連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器應(yīng)器，而適用于，而適用于填充式反應(yīng)器填充式反應(yīng)器。另一方面，如果固定化酶易變形、易粘結(jié)或顆另一方面，如果固定化酶易變形、易粘結(jié)或顆粒細(xì)小時，那么在填充于粒細(xì)小時，那么在填充于填充式反應(yīng)器填充式反應(yīng)器后，往往會后，往往會引起高的壓力降和堵塞床層，并且在大規(guī)模生產(chǎn)引起高的壓力降和堵塞床層，并且在大規(guī)模生產(chǎn)中無法實(shí)現(xiàn)高的流率。此時宜采用流動床反應(yīng)器。中無法實(shí)現(xiàn)高的流率。此時

39、宜采用流動床反應(yīng)器。4.8.24.8.2底物的物理性質(zhì)底物的物理性質(zhì)底物分三種情況：溶解性物質(zhì)、顆粒物質(zhì)與膠底物分三種情況：溶解性物質(zhì)、顆粒物質(zhì)與膠狀物質(zhì)。溶解性底物顯然對任何類型反應(yīng)器均不狀物質(zhì)。溶解性底物顯然對任何類型反應(yīng)器均不會造成困難。會造成困難。顆粒狀和膠狀底物則往往會導(dǎo)致床層堵塞，對顆粒狀和膠狀底物則往往會導(dǎo)致床層堵塞，對此可用循環(huán)反應(yīng)器或流動床反應(yīng)器。此可用循環(huán)反應(yīng)器或流動床反應(yīng)器。連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器只要攪拌速度足夠高，能維持只要攪拌速度足夠高，能維持底物和固定化酶良好的懸浮狀態(tài)，也可用于顆粒底物和固定化酶良好的懸浮狀態(tài)，也可用于顆粒狀底物。但高的攪拌速度會

40、導(dǎo)致固定化酶從載體狀底物。但高的攪拌速度會導(dǎo)致固定化酶從載體上被剪切下來，所以轉(zhuǎn)速不能太高上被剪切下來，所以轉(zhuǎn)速不能太高4.8.34.8.3酶反應(yīng)動力學(xué)特性酶反應(yīng)動力學(xué)特性 一般而言，填充床反應(yīng)器在固定化酶反應(yīng)器一般而言，填充床反應(yīng)器在固定化酶反應(yīng)器中占有主導(dǎo)地位，它適合于產(chǎn)物抑制的場合；但中占有主導(dǎo)地位，它適合于產(chǎn)物抑制的場合；但在底物抑制的系統(tǒng)中，則在底物抑制的系統(tǒng)中，則連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器的的性能又優(yōu)于填充床。流動床反應(yīng)器因其流動特性性能又優(yōu)于填充床。流動床反應(yīng)器因其流動特性接近接近連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器，故也適宜于底物抑制，故也適宜于底物抑制的反應(yīng)

41、。的反應(yīng)。4.8.44.8.4酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性在反應(yīng)器操作過程中，由于攪拌漿或液流的剪在反應(yīng)器操作過程中，由于攪拌漿或液流的剪切作用，常會使固定的酶從載體上脫落下來，或切作用，常會使固定的酶從載體上脫落下來，或由于磨損，引起粒度的減小而影響固定化酶的操由于磨損，引起粒度的減小而影響固定化酶的操作穩(wěn)定性，其中尤以作穩(wěn)定性，其中尤以連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器最為嚴(yán)最為嚴(yán)重。重。為解決這一問題而改進(jìn)反應(yīng)器設(shè)計(jì)，是把酶直為解決這一問題而改進(jìn)反應(yīng)器設(shè)計(jì)，是把酶直接粘接在攪拌軸上，或把固定酶設(shè)置在與軸相連接粘接在攪拌軸上，或把固定酶設(shè)置在與軸相連的金屬網(wǎng)籃內(nèi)。的金屬網(wǎng)籃內(nèi)。4.8.54.8.5操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用 連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器是最便宜的，它結(jié)構(gòu)簡是最便宜的，它結(jié)構(gòu)簡單，且具有良好的操作性，適應(yīng)性強(qiáng)；而其他類單，且具有良好的操作性，適應(yīng)性強(qiáng)；而其他類型的反應(yīng)器，則都需為特定的生產(chǎn)過程專門設(shè)計(jì)型的反應(yīng)器，則都需為特定的生產(chǎn)過程專門設(shè)計(jì)和制造。在討論反應(yīng)器價格的同時，還應(yīng)該考慮和制造。在討論反應(yīng)器價格的同時，還應(yīng)該考慮固定化酶本身的費(fèi)用，及在各種反應(yīng)器中的