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1、1三親本雜交:實(shí)驗(yàn)中,將供體菌、協(xié)助菌與受體菌混合起來,使菌體細(xì)胞緊密接觸,供體中的質(zhì)粒可以 在協(xié)助菌的幫助下通過接合轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入受體菌屮。由于所用供體質(zhì)粒屮不含轉(zhuǎn)移基因tra,所以,該接合 轉(zhuǎn)移必須有輔助菌株e.coli參加才能完成(輔助菌株中含tra基因),因此該接合轉(zhuǎn)移過程稱為三親本雜交。2電轉(zhuǎn)化原理.影響因素:原理:電穿孔法即是在外加短時(shí)強(qiáng)電脈沖時(shí),在細(xì)胞膜雙脂層上形成瞬時(shí)微孔,使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng), dna等人分子得以進(jìn)入細(xì)胞的一個(gè)工物物理過程。其細(xì)胞學(xué)原理是細(xì)胞處于電場(chǎng)中時(shí).細(xì)胞膜起著電容器 的作用。電流不能通過,隨著電壓升高,細(xì)胞膜組分被極化,并在細(xì)胞膜兩邊產(chǎn)生電位差。當(dāng)電位差超

2、過 某一臨界水平,細(xì)胞膜局部被擊穿,形成一瞬時(shí)的孔洞,孔徑人小足以讓人分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。只要電場(chǎng) 強(qiáng)度和脈沖時(shí)間不超過臨界限度,這種通透性就是可逆的。影響因素:電學(xué)因素:當(dāng)電容值固定時(shí),轉(zhuǎn)化子數(shù)h隨電場(chǎng)強(qiáng)度升高而增加;在適當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度下,使用 較大電容或電阻,則轉(zhuǎn)化頻率提高。但同時(shí)細(xì)胞存活數(shù)下降。電介質(zhì):介質(zhì)的離子強(qiáng)度影響脈沖時(shí)間, 強(qiáng)度高則脈沖時(shí)間短,應(yīng)采用低離子強(qiáng)度的電介質(zhì),避免轉(zhuǎn)化時(shí)存在高鹽濃度。dna濃度:轉(zhuǎn)化細(xì)菌時(shí), 質(zhì)粒dna濃度在一定范圍內(nèi),濃度增高與獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)星顯線性關(guān)系。dna濃度超過一定范圍,則轉(zhuǎn) 化子數(shù)目的增加趨于飽和。菌種及生理狀態(tài):細(xì)菌中g(shù)ram陰性細(xì)菌比厚壁的陽性

3、菌易于轉(zhuǎn)化,真核 細(xì)胞電穿孔的電場(chǎng)強(qiáng)度比細(xì)菌高;轉(zhuǎn)化效率和細(xì)胞的存活率與細(xì)菌的牛長(zhǎng)階段冇關(guān)。對(duì)于多數(shù)細(xì)菌來說, 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)敏感,電激后細(xì)胞死亡率高,但存活的細(xì)胞易于接受外來dna,所以用對(duì)數(shù)中 期的細(xì)胞較為適宜。另冇少數(shù)gram陽性菌則培養(yǎng)到穩(wěn)定器時(shí)易于轉(zhuǎn)化。3質(zhì)??焖贆z測(cè)法:原理:不經(jīng)抽提純化等步驟,直接在凝膠點(diǎn)樣孔中將質(zhì)粒從菌體中分離:菌體先加溶菌酶和rna酶,在冰 上裂解菌體。再將己裂解點(diǎn)入含冇sds凝膠帶的瓊脂糖凝膠中。sds在堿性條件卜沉淀菌體蛋白和帶組蛋 白的染色體碎片,沉淀留在點(diǎn)樣孔中。質(zhì)粒dna不帶蛋白質(zhì),得以釋放,在電場(chǎng)作用下進(jìn)入凝膠。注意事項(xiàng):供試菌株要充分活

4、化,收集菌液不宜太濃;裂解液添加適量,裂解時(shí)間在半小時(shí)以上,至 菌液變清亮后方可點(diǎn)樣;在較低室溫卜操作;避免劇烈抽吸、農(nóng)蕩、高溫;點(diǎn)樣時(shí)不要冇氣泡,不 要溢出點(diǎn)樣孔。4光學(xué)顯微鏡性質(zhì):放大倍數(shù):與透鏡的焦距成反比,與光學(xué)筒長(zhǎng)成正比;工作距離:物鏡下透鏡的下表面與載片物像的距離。物鏡放人倍數(shù)愈人,工作距離愈??;焦距:平行光線經(jīng)透鏡折射后的匯聚點(diǎn)與透鏡中心的距離;數(shù)值口徑(na):其大小與顯微鏡的分辨率有關(guān);焦深:物鏡視野中能清晰觀察到物像的垂直范闈。一般隨物鏡放人倍數(shù)增加而減小;分辨力:指分辨物體最小間隔的能力;色差:系白色光經(jīng)透鏡后各單色光焦點(diǎn)不一致的現(xiàn)彖,一般町用一個(gè)含鈣的雙凸透鏡和外包兩個(gè)

5、含鉛的 單凸透鏡組成的消色差透鏡校正;球面像差:系入射透鏡中部和邊緣部分的光線折射后在不同的點(diǎn)上聚焦而產(chǎn)生,可用含多組透鏡的消錯(cuò) 透鏡來校正;像散:系透鏡在成像過程中使物像在水平或垂直軸面上產(chǎn)生分散的現(xiàn)象;(10)慧形像差:系透鏡在成像過程中產(chǎn)生慧形拖尾的現(xiàn)象;)像場(chǎng)彎illi:系透鏡在成像過程中發(fā)牛的像場(chǎng)彎illi的現(xiàn)象;(12)畸變:系透鏡在成像過程屮產(chǎn)生畸形像場(chǎng)的現(xiàn)象。4相差顯微鏡原理、優(yōu)點(diǎn)及使用方法:原理:相差顯微鏡一種將光線通過透明標(biāo)木細(xì)節(jié)時(shí)所產(chǎn)心的光程弟(即相位差)轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)弟的特種顯微 鏡。相差顯微鏡與普通顯微鏡主要不同之處在于用環(huán)狀光欄代替可變光欄,用帶和板的物鏡代替普通物鏡,

6、 并帶有一個(gè)合軸調(diào)屮望遠(yuǎn)鏡及濾色片。這些特殊裝置能使活細(xì)胞或末經(jīng)染色的標(biāo)本中各部分的折射率或厚 度的微小差異,產(chǎn)生相位差,然后利用光的衍射和干涉的原理,把相差變成振幅(明暗)之差,使人的肉眼 能夠辨認(rèn)出來。相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細(xì)節(jié),適用于對(duì)活體細(xì)胞生活狀態(tài)下的生長(zhǎng).運(yùn)動(dòng)、增殖 情況及細(xì)微結(jié)構(gòu)的觀察。使用方法:依次將物鏡換為相差物鏡,聚光器換為相聚光器,并升至最高位置,并在視場(chǎng)光闌處加上黃 綠色濾光片。將活體標(biāo)本放在鏡臺(tái)上,把相聚光器調(diào)至10處,用1ox相差物鏡觀察并調(diào)節(jié)至物像清晰。 將目鏡換成合軸調(diào)整望遠(yuǎn)鏡,把上透鏡適當(dāng)旋出并調(diào)節(jié)使相板上的亮環(huán)少暗環(huán)準(zhǔn)確聚焦。調(diào)節(jié)相聚光 器兩側(cè)的調(diào)節(jié)旋

7、鈕(或插入式調(diào)節(jié)桿),使亮環(huán)準(zhǔn)確的與暗環(huán)重合。將合軸調(diào)整瑕遠(yuǎn)鏡重新?lián)Q為h鏡進(jìn) 行低倍鏤觀察,并將物像調(diào)至視野中部。依次按的步驟進(jìn)行20x, 40x物錢和1oox油鏡觀察。注總事項(xiàng):a一定要將聚光器升至最高位置;b相差物鏡與相聚光器一定婆匹配,否則無法使亮環(huán)暗 環(huán)重合;c視野亮度應(yīng)隨物鏡倍數(shù)升高而加大。5熒光顯微鏡原理與操作方法:原理:標(biāo)木物像內(nèi)部的熒光物質(zhì)或經(jīng)熒光染料染色的標(biāo)木經(jīng)紫外光短波光激發(fā)后能發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光, 上述標(biāo)本可以用熒光顯微鏡觀察。常用的生物細(xì)胞內(nèi)部的熒光物質(zhì)主要有熒光索和綠色熒光蛋白等。熒光 染料主要冇金胺叮噪橙異硫鼠酸熒光黃、羅丹明b和熒光抗體等。使用方法:開啟電源轉(zhuǎn)換器

8、上主開關(guān)后,再按卜啟動(dòng)鈕將汞燈點(diǎn)燃。先用普通光將待檢樣品在10x 物鏡下聚焦,根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的激射和熒光性質(zhì)選擇適合的激射光與分色片組合。關(guān)閉普通光,移動(dòng)汞燈 光路控制拉桿使紫外光射出,適當(dāng)調(diào)節(jié)汞燈視場(chǎng)光闌,使之在視野中可見,再適當(dāng)縮小孔徑光闌使物像反 差適當(dāng)。觀察完畢后將物像移至屮部依2、3介紹的方法作20x、40x物鏡觀察。進(jìn)行汕鏡觀察時(shí),應(yīng) 采用無熒光硅油,并在載片樣而上部和聚光器上部(使用透射式熒光顯微鏡吋)均滴上硅油。6顯微操作術(shù):在顯微鏡卞分離單個(gè)生物細(xì)胞、細(xì)胞器或從物理混合物中分離單一微小物體的方法稱為顯 微操作法或顯微操作術(shù)。7熒光定量pcr原理及應(yīng)用:原理:定屋pcr指佔(zhàn)算樣本

9、中的原始模板數(shù)。它是通過一定循環(huán)次數(shù)的pcr的擴(kuò)增后,pcr產(chǎn)物量來判 斷品質(zhì)的原始模板數(shù)。定量pcr是以pcr擴(kuò)増為基礎(chǔ)的,而pcr擴(kuò)増是有規(guī)律可循的。定量一般是在pcr 擴(kuò)坍的指數(shù)期進(jìn)行的。如果用no代表pcr反應(yīng)中的原始模塊數(shù),n為擴(kuò)增次數(shù),那么擴(kuò)增產(chǎn)物的初期直 線增長(zhǎng):而經(jīng)過-定循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增后,進(jìn)入平臺(tái)期。定mpcr就是在指數(shù)增長(zhǎng)期實(shí)現(xiàn)對(duì)原始摸板定量的(備 注:在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)n=no(1+c)n,如果知道擴(kuò)增的產(chǎn)物最n及pcr擴(kuò)增的效率c,便可知道原始模塊no 值。)熒光定量pcr技術(shù)融匯pcr和dna探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),直接pcr過程屮熒光信號(hào)的變化,根據(jù)pcr反應(yīng)酶動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),獲得

10、dna模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果。 應(yīng)用:實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)是dna定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù),我們可以對(duì)dna、rna樣 品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括絕對(duì)定量分析和相對(duì)定是量分析。前者可以得到菜個(gè)樣木中基因的 拷貝數(shù)和濃度;后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的堆因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外我們不定期可 以對(duì)pcr產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析:例如利用熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體。以區(qū)分菲特異擴(kuò) 增;利用特片性探針進(jìn)行基因型分析及snp檢測(cè)等。h前實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué) 研究、臨床診斷、疾病硏究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面:比較經(jīng)過不處 理

11、樣木z間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理.物理處理、化學(xué)處理等),及特定基因在不同相的表達(dá)差異。 比較正常組織與病理組織中各種mrna表達(dá)量差異。驗(yàn)證基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果。驗(yàn)證rna t擾實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。熒光定量pcr技術(shù)的兩種檢測(cè)模式:(dsybr green i檢測(cè)模式:sybr green i是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈dna結(jié)合染料,與雙鏈dna結(jié)合后, 其熒光大大增強(qiáng)。pcr溫度循環(huán)為945572°c三步法,只冇引物,無探針,熒光染料特異性地?fù)饺雂na 雙鏈后,發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào),而不摻入鏈小的sybr熒光染料僅冇微弱熒光信號(hào)背景。該方法通過對(duì)特定方 向的強(qiáng)熒光檢測(cè)獲得信號(hào),這種試劑檢測(cè)模式

12、易產(chǎn)生非特異信號(hào),且本底光較大。此外,由于一個(gè)pcr產(chǎn) 物可以與多個(gè)分子的染料結(jié)合,因此sybr green i的檢測(cè)靈敏度很高。但是,由于sybr green【與所冇 的雙鏈dna和結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會(huì)影響定量的 精確性。通過測(cè)屋升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。山熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一 性有助于更準(zhǔn)確地分析sybr green i real-time pcr定杲結(jié)果。解探針模式:溫度循環(huán)為9460° c二 步法,不僅冇引物,還冇另外一個(gè)特異針對(duì)擴(kuò)增模板的探針在引物對(duì)z間。在探針相鄰兩個(gè)堿基上分別結(jié) 合兩個(gè)熒光染料,

13、一個(gè)染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個(gè)染料,接受能量的第二個(gè)染料通過發(fā)射特 征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當(dāng)taq酶在60° c延伸擴(kuò)增鏈時(shí),遇到探針,利用taq酶5 一3外切酶活性將探針 水解成單個(gè)堿基,單個(gè)堿基之間距離較遠(yuǎn),第一個(gè)染料的能量無法傳給第二個(gè)染料,只好通過發(fā)射特征光 子回到穩(wěn)定態(tài),通過對(duì)溶液屮第一個(gè)染料的熒光檢測(cè)獲得信號(hào)。這種試劑檢測(cè)模式增加了檢測(cè)信號(hào)的特異 性,但是由于利用了 taq酶5, 一3夕卜切酶活性,一般試劑廠家只給taq酶的聚合酶活性定標(biāo),沒有同時(shí) 給taq酶5 一3外切酶活性定標(biāo),不同批號(hào)試劑之間會(huì)給定量帶來差異。另外對(duì)探針的熔點(diǎn)溫度(tm) 僅要求英高于6()。

14、c,這就使不同試劑盒z間的特異性參差不齊,而且無法做質(zhì)控檢測(cè)。9熒光定量pcr技術(shù)如何獲得樣品的起始拷貝數(shù)(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法)?所謂的實(shí)時(shí)熒光定mpcr,其反應(yīng)體系中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行,pcr反應(yīng) 產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過-個(gè)循環(huán),收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣我們就可以 通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到-條熒光擴(kuò)增曲線。一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分三個(gè) 階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)坍階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)増的熒光信號(hào)被熒 光背景信號(hào)所掩蓋,我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。pcr的

15、 終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,所以根據(jù)最終的pcr產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始dna拷貝數(shù)。只 冇在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段,pcr產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè) 階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定ttpcr技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒 光閾值和ct值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段 任意位置匕 但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3j5個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng) 管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為ct值。定量熒光擴(kuò)增曲線是熒光量少循環(huán)數(shù)的圖表。熒光閾值線的位置一般

16、事實(shí)上位于減去木底的位置上,這時(shí) 的熒光信號(hào)超過了熒光背景信號(hào)并且開始增加。對(duì)某一樣品的c值就定義為熒光量與熒光閾值線交義時(shí) 的循環(huán)數(shù)。ct值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個(gè)模板的ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān) 系,起始拷貝數(shù)越多,ct值越小。利用己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)川1線,英中橫坐標(biāo)代表ct值, 縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。因些只要獲得未知樣品的ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣甜的起始 拷貝數(shù)。10宏基因組學(xué):環(huán)境宏基因組定義:不依賴于培養(yǎng)物的微生物群落基因組分析或環(huán)境微生物菌群的混合基因組分析。宏蛋白組學(xué):大規(guī)模鑒定在一個(gè)特定的時(shí)間,微生物菌群產(chǎn)生的整個(gè)蛋白質(zhì)。確定

17、樣品中微生物的種類: 收集樣品一一提取dna構(gòu)建16srrna文庫(kù)一一測(cè)序分析。構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的過程:收集樣品一一提取dna一一葩切一一與載體連接一一轉(zhuǎn)化一一篩選轉(zhuǎn)化子一 確定基因。z后對(duì)文庫(kù)屮的dna進(jìn)行序列分析(測(cè)序,生物信息學(xué)分析,共他分析)和具冇特定表型的功 能篩選?;』钚裕üδ埽┑暮Y選:確定具有所需耍表型的克隆一一對(duì)選定的克隆進(jìn)行序列分析和生化分析一一對(duì) 冇用活性快速測(cè)定一一功能所需要的所冇基因都在一個(gè)克隆并在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。優(yōu)點(diǎn):能產(chǎn)生全新的基 因或化合物;缺點(diǎn):頻率低下,工作量人。基于序列分析的篩選:利用保守序列設(shè)計(jì)pcr引物或探針篩選整個(gè)宏基因紐文庫(kù)以獲得我們所感興趣的 克

18、隆。優(yōu)點(diǎn):不依賴于某因的表達(dá);缺點(diǎn):選擇性不好。功能基因的篩選策略:探索構(gòu)建新的載體.擴(kuò)大宿主范圍等提高宏基因的表達(dá)水平;通過富集特定 類群的基因組提高冃標(biāo)基因在文庫(kù)中的頻率.如在擬采樣壞境中添加穩(wěn)定同位索c標(biāo)記底物,與底物降解 冇關(guān)的微生物代謝活躍,c就進(jìn)入到英基因組屮,捉取帶c標(biāo)記的dna片段建庫(kù)則町以獲得較多的相關(guān) 底物降解活性克?。婚_發(fā)dna芯片和蛋白質(zhì)芯片提高篩選頻率;隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,宏基因組克 隆必將成為微生物活性物質(zhì)篩選的重耍手段并發(fā)揮巨大作用。11酵母雙雜交原理:酵母雙雜交技術(shù)是一種直接在酵母細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白與蛋白相互作用、靈敏性很高的遺傳學(xué)方法。許多真核 生物的轉(zhuǎn)錄激活因了由兩個(gè)或兩個(gè)

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