免疫熒光方法

1、免疫熒光（Immunofluorescence, IF ）實驗方法免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵 育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生

2、細胞掉片， 一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（Slides or Coverslips ）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結出 許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性 質選擇適當?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot ）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作， 此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4C或-20 C避光保存，以免

3、因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。由于操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WBB樣可以根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別，所以要得到一個完美的免疫熒光實驗結果，除了需要高質量的抗體，以及對實驗條件進行反復優(yōu)化外， 還必須設立嚴謹?shù)膶嶒瀸φ?。總之，免疫熒光實驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。基本實驗步驟：（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用 PB

4、S離心洗滌（1000rpm,5min ） 2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直 接制備細胞涂片。（2） 固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納 的PBS中4C保存3個月。PBS洗滌3X 5 min.（3）通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在 5-15min.通透后用PBS洗滌3X 5 min.（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.（5） 一抗結合。室溫孵育 1h或者4C過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5mi

5、n.（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次 沖洗5min后，再用蒸儲水漂洗一次。（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。（一）細胞準備用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內(nèi)的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養(yǎng)時直接放入coverslips 讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免 疫熒光實驗，以免后續(xù)的漂洗操作引起細胞脫落。少數(shù)實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。（二

6、）固定和通透除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三： 防止細胞從玻片上脫落； 除去防礙抗原-抗體結合的類脂； 使標本易于保存。標本的固定原則是： 不能損傷細胞內(nèi)的抗原； 不能凝集蛋白質； 應保持細胞和亞細胞結構； 固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。常用的固定劑有多種，應根據(jù)所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當?shù)墓潭?劑。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯(lián)劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂 并使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉淀。交聯(lián)劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產(chǎn)生一種抗原相互連接的網(wǎng)絡結構

7、。交聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的結構，但因為交聯(lián)阻礙抗體結合， 可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產(chǎn)的抗體在免疫熒光中可能更為有效。最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數(shù)情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。 通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內(nèi)的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。通透步驟只在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢

8、測蛋白。但是，如果待檢測的是跨 膜蛋白，且其抗原表位處于胞質內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位于 膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。 丙酮本身 具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40, 以及 Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm 等。Triton 和 NP-40 屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋

9、白，從而影響實驗結果。Triton X-100是最常用的通透劑， 但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質膜。適于胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗，最后以 蒸儲水沖洗，防止自發(fā)性熒光。（三）封閉封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PB

10、S pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有1% gelatin, 1%bovine或與二抗種屬相同的 血清（3-10%）等。（四）抗體孵育直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。 此外，為保證結合質量和防止干燥， 抗體孵育應盡量在濕盒中進行。（五）封片及熒光觀察標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數(shù)情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片 處理。常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。（六）標本保存由于熒光

11、色素和蛋白質分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之后應立即觀察。由于性能良好的抗熒光 淬滅劑的出現(xiàn),熒光標記的標本可以在低溫（4C或-20 C）下保存相當長的時間。 在某些情形下，考慮到實 驗的成本及實驗條件， 也可以采取權宜的辦法， 比如固定標本片后低溫保存，在需要時再進行熒光標記，即隨用隨染。直接免疫熒光法測抗原基本原理將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高， 非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制

12、備一種熒光抗體。 此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水（PB0 : 0.01mol/L , pH7.4熒光標記的抗體溶液：以 0.01mol/L , pH7.4的PBS進行稀釋緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M 碳酸鹽緩沖液1份配制搪瓷桶三只（內(nèi)有 0.01mol/L , pH7.4 的 PBS 1500ml）有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）熒光顯微鏡玻片架濾紙H37 C溫箱等。實驗步驟1、 滴加0.01mol/L , pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持一定濕 度。2、滴加適當

13、稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保 溫一定時間（參考： 30min）。3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L ,pH7.4的PBS7中洗后，再按順序過0.01mol/L , pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸 3-5 min ,不時振蕩。4、取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆 蓋。5、 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“ +”表示：（-）無熒光；（土）極弱的可疑熒光；（+ ）熒光較弱，但清楚可見；（+）熒光明亮；（+ -+ ）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達"+”以上，而各種對照

14、顯示為 （土）或（-）,即可判定為陽性。注意事項1、對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過 1: 20,抗體濃度過低，會導致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結果的觀察。2、 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10 min到數(shù)小時，一般 30 min已足夠。染色溫度多采用室溫（25C左右），高于 37C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2 C的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較 37C30 min效果好的多。3、為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒 光染色的干擾。(1) 標本

15、自發(fā)熒光對照：標本加 1-2滴0.01mol/L , pH7.4的PBS(2) 特異性對照(抑制試驗)：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性 抗體。(3) 陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒 光，則為特異性陽性染色。4、 一般標本在局壓汞次照射超過3min ,就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本最好 在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光染色(間接法)1、 切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持 一定的濕度，37C作用30min。然后用0.01mo

16、l/l pH7.2PBS洗兩次，10min,用吸水吸去或 吹干余留的液體。2、 再滴加間接熒光抗體(如兔抗人-球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，染色 30min ,37C,緩沖鹽水洗兩次10min,攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。對照染色：抗體對照：用正常兔 血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結 果應為陰性。抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。陽性對照。間接法中上述方法稱雙層法(Double Layer Method )。另一種稱夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其 上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下： 切片或涂

17、片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。 滴加未標記的特異性抗原作用切片于37 C , 30min。 緩沖鹽水洗2次，每次5min,吹干。 滴加特異性熒光抗體再用切片于37C, 30min。 如水洗。 緩沖甘油封固，鏡檢。易生物實驗技術頻道-生物實驗技術資料庫！細胞內(nèi)抗原的檢測-間接免疫熒光法細胞內(nèi)抗原的檢測過程與細胞表面抗原檢測過程基本一致，只是在與一抗孵育前， 需要預先對細胞用非離子去污劑進行透化處理?！静僮鞣椒ā?1) 取已固定好的細胞爬片或甩片或經(jīng)過預處理的組織切片(石蠟或冰凍切片)；(2) 用含0.2%TritonX-100 或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min (室溫)，有 些標本可

18、能需要長達 15min ,時間視抗原而定；(3) 余下步驟接上述“細胞表面抗原的檢測-間接免疫熒光法”步驟(2);【注意事項】(1) 在使用前，一抗二抗均應測試其合適的稀釋度。（2）多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標本經(jīng)多聚甲醛固定后，應再用去污劑處理，如果標本在水溶液中浸泡的時間過長，則會使交聯(lián)結構解體。 因此，應避免固定后的標本在水溶液中浸泡的時間過長。（3）信號微弱的解決方法： 提高一抗和二抗的濃度以增強敏感性，這必須測試各種濃度抗體的滴度； 延長一抗和二抗的孵育時間。由于細胞染色時抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結合時間較在溶液中長。孵育時間可因實驗設計作適當調(diào)整，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結合。在