一種新的人胚胎干細(xì)胞自身來源的滋養(yǎng)層支持其體外培養(yǎng)

1、1*1 1=1sKfs4 JL*一種新的人胚胎干細(xì)胞自身來源的滋養(yǎng)層支持其體外培養(yǎng)1安世民1本課題得到國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃(973)項目(2004CB518601 )和國家自然科學(xué)基金重點項目30730052 )的資助。 并列第一作者。，曾橋*，滕祥云，龍志高，李娟，潘乾，鄔玲仟，梁德生，夏昆，夏家輝，張灼華中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室，長沙(410078)E-mail: nlmglcy摘 要：通過人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs )經(jīng)體內(nèi)分化獲取間充質(zhì)干 細(xì)胞(mesenchymal stem cells ， MSCs)為人胚胎干細(xì)胞提

2、供一種新的滋養(yǎng)層。將約5X 10個hESCs注射入重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠形成畸胎瘤，8周后再從畸胎瘤中分離 MSCs并鑒定，將MSCs作為hESCs的滋養(yǎng)層細(xì)胞，并檢測和觀察hESCs的生長情況、細(xì)胞特性和分化能力。從畸胎瘤中獲得了純度較高的具有類似骨髓來源的MSC特性的細(xì)胞群，其形態(tài)相似、表面抗原標(biāo)志相似(CD34和CD45陰性，CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90陽性)，經(jīng) 誘導(dǎo)可以向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化。將hESCs在MSCs滋養(yǎng)層細(xì)胞上傳代培養(yǎng) 10代以上，hESCs依然具有正常的細(xì)胞形態(tài)，反轉(zhuǎn)錄PCR證實其特異轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Nanog的表達(dá)，干細(xì)胞表面標(biāo)記 SS

3、EA-1顯示為陰性，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81顯示為陽性，堿性磷 酸酶染色顯示為陽性，并且核型正常。體外EB形成和體內(nèi)畸胎瘤形成證明了其全能性。因此來源于hESCs本身的MSCs可以被用來作為支持胚胎干細(xì)胞生長并維持其未分化狀態(tài)的 滋養(yǎng)層細(xì)胞。關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，滋養(yǎng)層中圖分類號：Q2-331. 引言人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs )來自于早期的囊胚或桑椹胚，它具有以下兩個最重要的特性：全能性和自我更新能力。該特性使得其在再生醫(yī)學(xué)和器官移植等領(lǐng)域具有潛在的重大意義。自從1998年美國威斯康星大學(xué)的Thoms

4、on教授建立世界上第一株胚胎干細(xì)胞系到目前為止，在NIH 已經(jīng)注冊了 70株胚胎干細(xì)胞系1 (/)。大多數(shù)人胚胎干細(xì)胞系是培養(yǎng)在來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cells, MEF )的滋養(yǎng)層細(xì)胞上，MEF細(xì)胞通過與 hESC直接接觸及分泌多種因子維持人胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)。這種培養(yǎng)體系中的hESCs在應(yīng)用于臨床治療時存在多個障礙，其中之一是動物源性病原體的交叉污染2。因此如何建立一種人源性的培養(yǎng)體系，避免治療中動物源性污染有著重大意義。本研究通過將hESCs進(jìn)行體內(nèi)分化得到MSCs并作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，

5、對培養(yǎng)在MSCs上的hESCs進(jìn)行傳代觀察，以期研究和建立一種適合于hESCs的人源化滋養(yǎng)層培養(yǎng)體系。2. 材料與方法2.1材料2.1.1胚胎干細(xì)胞和實驗動物本實驗采用的胚胎干細(xì)胞是購自美國NIH注冊的HSF6胚胎干細(xì)胞株，核型46,XX ;實 驗小鼠是購自北京維通利華動物有限公司的 SCID-beige小鼠。2.1.2主要試劑Mesencult Media購自STEM CELL 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM-F12 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；血清替代物（knockout serum replacement）、Knockout DMEM、谷氨酰胺、禺巰基乙醇、非必需氨基酸、雙抗、人堿

6、性成纖維生長因子 （basic fibroblast growth factor, bFGF ）、 分散酶（Dispase）和IV型膠原酶（Collagenase Type IV卜胰酶、Hank's平衡鹽溶液、PBS購 自 Invitrogene 公司；明膠（Gelatin ）購自 sigma 公司；堿性磷酸酶（alkaline phosophotase, AKP ） 檢測試劑盒購自 Vector Lab公司；胚胎干細(xì)胞鑒定試劑盒 （ES CELL CHARACTERIZATION KIT ）購自 Chemicon 公司；PE 標(biāo)記的小鼠抗人 CD73、CD90、CD29、CD49b、

7、CD34 以及 FITC標(biāo)記的CD14、CD45購自BD pharm in gen公司。絲裂霉素 C、地塞米松、3-磷酸甘油、 IBMX、胰島素購自 sigma公司。2.2方法2.2.1畸胎瘤形成常規(guī)傳代培養(yǎng)hESCs的方法見文獻(xiàn)3，機械切割法和酶消化法均可。將長至 80-90%融 合的約5X 10 hESCs通過酶消化法收集， 注射4到8周齡的SCID-beige小鼠后腿肌間隙，經(jīng) 過約8周后，將SCID-beige小鼠行斷頸處死，在無菌條件下取出畸胎瘤。2.2.2間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的獲取 在無菌條件下，將畸胎瘤剪碎，37C胰酶消化20分鐘，加入含有10%FBS的Mesencult培養(yǎng)基

8、中止消化，吹打至單細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘， 加含有10%FBS的Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，每天加 bFGF至10ng/mL。待細(xì)胞長 至90%匯合度后，傳代培養(yǎng)。2.2.3 MSC向成骨和成脂誘導(dǎo)成骨誘導(dǎo)：將長至 80%左右匯合度的P3、P6代細(xì)胞消化，以1X 10個/cm2的密度接種 于24孔板，Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度達(dá)95%左右時換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基：咼糖DMEM、地塞米松（10- M ）、3磷酸甘油（10mM ）、抗壞血酸（50卩g/mL。每3-4天全 量換液。對照孔用 Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo) 4周后用Von Kossa法染色鑒定和堿性

9、磷酸 酶染色。成脂誘導(dǎo)：將長至80%左右匯合度的P3、P6細(xì)胞消化，以1X 10個/cm2的密度接種于24孔板，Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)；待細(xì)胞匯合度達(dá)95%左右時換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM/F12、FBS （1%）、地塞米松（10-7 M ）、胰島素（6ng/ml）、IBMX （100ug/mL）。 每34天全量換液。對照孔用Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo) 3周后用油紅 O法染色鑒定。2.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測MSC表面標(biāo)志將P2代或P7代的MSCs通過0.05%的胰酶消化收集，用 PBS懸浮調(diào)整密度到 1.0至 5.0 X 1（個/mL，將細(xì)胞與 CD105 （ SH2 ）、CD73（

10、 SH3 和 SH4）、CD90、CD45 和 CD34 以 及對照抗體室溫孵育 30分鐘，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，用 1%多聚甲醛固定細(xì)胞，流式細(xì)胞 術(shù)檢測。2.2.5 MSCs作為滋養(yǎng)層細(xì)胞將P3或P7代的MSCs以及對照細(xì)胞 MEF細(xì)胞鋪于六孔板中，待其長至95%融合時，用絲裂霉素 C處理：37C、5%CO2培養(yǎng)箱中處理2.5小時后，用10%FBS加DMEM培養(yǎng)基-1 -AJL*UJBlflB 血疋 XtC 口" S" * rK1洗滌5次，加培養(yǎng)基過夜。第二天在將胚胎干細(xì)胞鋪于滋養(yǎng)層細(xì)胞之前一個小時將培養(yǎng)基換 成胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。 將傳代的胚胎干細(xì)胞克隆團(tuán)塊鋪于滋養(yǎng)層細(xì)

11、胞之上，加bFGF至終濃度為10ng/mL，每日換液。2.2.6 hES細(xì)胞特異性抗原和核型鑒定將hESCs在MSCs滋養(yǎng)層細(xì)胞上傳代培養(yǎng) 10代以后，用胚胎干細(xì)胞鑒定試劑盒進(jìn)行鑒 定。4%多聚甲醛室溫固定30分鐘，羊血清室溫封閉抗原，分別加入小鼠抗人 SSEA-1(stage-specific embryonic antigen-1)、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 單克隆抗體染色 37 C孵育1小時后，加入熒光標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37 C孵育30分鐘，PBS洗滌后，熒光顯微鏡觀察。按照說明書用堿性磷酸酶(AKP )檢測試劑盒染色檢測。常規(guī)行G顯帶核型鑒定。2.2.7反轉(zhuǎn)錄

12、PCR實驗檢測ES細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子收集hES細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄PCR , GAPDH 引物上游序列： AATCCCATCACCATCTTCCA ，下游序列：TGAGTCCTTCCACGATACCAA ; Oct4 弓 I物上 游序列：AAGGGCAAGCGATCAAGC ，下游序列：GGAAAGGGACCGAGGAGTA ; Nanog 弓 I物上游序列： CCTATGCCTGTGATTTGTGG ，下游序列：GAAGTGGGTTGTTTG CCTTT 。 退火溫度均為57 C。2.2.8 ES細(xì)胞體內(nèi)外分化能力檢測將ES細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)進(jìn)行 EB形成試驗測試其體外分化能力檢測；

13、將 ES細(xì)胞進(jìn)行SCID-beige小鼠體內(nèi)畸胎瘤試驗測試其體內(nèi)分化能力檢測。3. 結(jié)果3.1畸胎瘤形成在將hESCs注射入SCID-beige小鼠后腿肌間隙后，在第4周的時候可以明顯看到腫塊隆起，在第8周取出畸胎瘤。3.2 MSCs的培養(yǎng)原代MSCs 48h后可見許多細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)多為圓形，偶見短梭形細(xì)胞。第23天可見由幾個短梭形細(xì)胞組成的小集落， 散在分布的細(xì)胞形態(tài)多呈短梭形或多角形， 個別細(xì) 胞寬大扁平。35天后細(xì)胞生長加速，7天左右接近匯合，此時細(xì)胞形態(tài)多為梭形， 核居中，可見23個核仁。傳代后的細(xì)胞 24h內(nèi)完全貼壁并伸展為梭形，均勻分布生長，23天即可傳代一次，細(xì)胞以梭形為主A

14、BFig. 1 Phase contrast image of MSCsA: Primary MSCs culture ; B: MSCs culture, Passage 5 (x 10);3.3 MSCs向成骨誘導(dǎo)MSCs經(jīng)在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，可觀察到少許 MSCs細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由梭形向多角形轉(zhuǎn)變，并且隨時間推移越來越多，聚集成團(tuán)。3周后，看觀察到較大的細(xì)胞結(jié)節(jié)。在第4周，用Von Kossa法染色可以看到黑色結(jié)節(jié)，表明鈣沉積的情況。成骨細(xì)胞因包 埋在鈣化基質(zhì)中所以細(xì)胞輪廓不清楚。堿性磷酸酶活性是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志之 一，在誘導(dǎo)第2周時，經(jīng)染色后表現(xiàn)為強陽性。對照組染

15、色結(jié)果為陰性。-5 -AJL*UJBlflB 血疋 XtC 口" S" * rK1x 10)Fig. 3 Staining of MSCs after adipogenic inductionA: Lipid vacuole in MSCs ( x 40); B: Oil red O staining shows red adipocyte(Fig. 2 Staining of MSCs after osteogenic inductionA: Vonkonssa staining shows mineralization deposits(x 20); B: Alkali

16、ne phosphatase staining (3.4 MSCs向成脂誘導(dǎo)MSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 1周后，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)微小脂滴；隨著時間推移,脂滴數(shù)目逐漸增多，并且脂泡開始長大。第3周時，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)富集的脂質(zhì)小泡。 油紅O染色法顯示脂滴呈橙紅色，胞核顯示藍(lán)色。對照組未見脂滴。x 10)3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs表面標(biāo)志流式細(xì)胞術(shù)檢測 MSCs表面標(biāo)記顯示 CD45和CD34陰性，而P3至P7的MSCs約85% 到 97%顯示 CD29、CD49b、CD105 (SH2)、CD73( SH3 和 SH4)、CD90 陽性。其他的非 陽性的細(xì)胞可能是已分化的MSCs或其

17、它尚未分化的干細(xì)胞。-# -m*-i =1 MX!-A JL*UJBlflB 血疋 XtCVE s ! _ 、 4ToSL5s呂畐 0§8s導(dǎo)a0aunQvCD34 PE"mzFig. 4 Expression of surface markers of MSCs analyzed by flow cytometry.3.6培養(yǎng)在MSCs滋養(yǎng)層細(xì)胞上的胚胎干細(xì)胞將hESCs傳代至MSCs滋養(yǎng)層細(xì)胞上后，細(xì)胞依然呈圓形克隆性生長，并且保持未分 化狀態(tài)。克隆邊界清楚，生長狀態(tài)良好。與培養(yǎng)在MEF滋養(yǎng)層上的對照組相比， MSCs滋養(yǎng)層上的hESCs生長速度較慢。經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)，其

18、克隆形態(tài)未發(fā)生明顯變化。Fig. 5 Growth of hESCsA: hESCs grows on MEF feeder cells(x 10)； B: hESCs grows on MSC feeder cells (x 10)3.7胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記物和特異性轉(zhuǎn)錄因子鑒定將培養(yǎng)在 MSCs滋養(yǎng)層上的胚胎干細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代10代后，進(jìn)行SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示 SSEA-1 陰性，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 陽性。經(jīng)堿性磷酸酶染色鑒定，顯示堿性磷酸酶陽性。G顯帶核型分析顯示為正常核型 46,XX。通過反轉(zhuǎn)錄

19、PCR證實了 hES細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 Oct4和Na nog基因的表達(dá)，表明其 細(xì)胞全能特At生未變。)| 1( tiII HI£J4h)H ») il H :; Hb?* fl ! U *i ii ti n ii HFig. 6 Characterization of hESCsA: Staining of hESCs shows SSEA-1 negative, SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81 positive ( x 10)； B: Alkaline phosphatase staining of hESCs shows positive (x 1

20、0); C: Karyotype analysis shows normal; D: Electrophoresis ofhESCs specific transcription factors3.8分化能力檢測Fig. 7 hESCs form EB in vitro cluture and teratoma in SCID mouse培養(yǎng)在MSCs滋養(yǎng)層細(xì)胞上的hES細(xì)胞體外分化能形成 EB,體內(nèi)分化能形成畸胎瘤, 表明了培養(yǎng)在 MSCs上的hESCs具有全能分化潛力。4. 討論人胚胎干細(xì)胞由于其潛在的巨大應(yīng)用價值而成為當(dāng)今重要的研究對象。目前大多數(shù)胚胎干細(xì)胞系都是在鼠源性的MEF滋養(yǎng)層上

21、培養(yǎng)。通過這種滋養(yǎng)層細(xì)胞建立和培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞系存在著動物源性蛋白，并且可能會被感染性的動物源性病毒如逆轉(zhuǎn)錄病毒污染，因此極大的限制了這些細(xì)胞株對于臨床用途的潛在價值2。因此，許多新的胚胎干細(xì)胞系試圖建立在無外源物質(zhì)的培養(yǎng)體系中。目前，科學(xué)家們嘗試了一些使用人源滋養(yǎng)層細(xì)胞來培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞系，如人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胎兒肌肉或胎兒皮膚細(xì)胞5、新生兒包皮成纖維細(xì)胞6、成人子宮內(nèi)膜細(xì)胞 、人胎盤成纖維細(xì)胞8。然而，各種不同的來源的細(xì)胞具有不 同的能力以支持hESCs的生長，并不是所有人源細(xì)胞都能很好地支持hES細(xì)胞的生長Richards M等人比較了幾種不同的人源滋養(yǎng)層細(xì)胞9，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果相對

22、MEF要差。用人源滋養(yǎng)層細(xì)胞比如胎兒組織存在很多倫理問題，而且用異體基因來源的細(xì)胞仍存在一定的交叉污染危險。Carpenter MK等人建立了 hES細(xì)胞無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系10，以及Li Y等人發(fā)現(xiàn) 無飼養(yǎng)層細(xì)胞無血清的培養(yǎng)體系亦可以成功的維持hES細(xì)胞的生長11。對ES細(xì)胞自體來源滋養(yǎng)層的研究，研究報道從ES細(xì)胞自體分化得到的成纖維細(xì)胞也具有支持ES細(xì)胞未分化生長的能力，這不僅在hES細(xì)胞的研究中得到了該結(jié)論12-14，在老鼠的ES細(xì)胞中也得到了相似的結(jié)果15。近來的研究報道了多種 hES細(xì)胞經(jīng)體外自發(fā)分化16或者與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)17而獲得高 純度MSCs方法。我們的研究表明，將hES細(xì)胞注

23、射入重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠形成畸胎瘤，-7 -1=1-M- -A - JL*LU S01IHtl再從畸胎瘤中可以得到高純度的類似的MSCs。從hES細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)分化得到大量的純度較高的MSCs，這對于將來研究 MSCs的生物學(xué)特性和治療用途都具有重要的意義。這些來源于胚胎干細(xì)胞本身的MSCs，由于經(jīng)過了在重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠形成畸胎瘤的階段，所以從一定程度上減少了這些MSCs潛在的病毒污染的可能性。因為如果有可能的病毒污染，則會導(dǎo)致重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠的死亡，從而hES細(xì)胞在重癥免疫聯(lián)合缺陷小鼠身體內(nèi)無法獲得畸胎瘤。這些來源于hES細(xì)胞本身的MSCs可以被用來作為支持 hES細(xì)胞生長并維持其未分化

24、 狀態(tài)的滋養(yǎng)層細(xì)胞。這些MSCs可能像MEF 樣，可以分泌一些維持 hES細(xì)胞未分化狀態(tài)和促進(jìn)其生長的因子。通過對培養(yǎng)于 MSCs上的hES細(xì)胞進(jìn)行特異性轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Na nog的反轉(zhuǎn)錄PCR和hES細(xì)胞特異性抗原染色，證實了hES細(xì)胞的全能性指標(biāo)。和其他人源性的滋養(yǎng)層細(xì)胞的研究相比，本研究中使用的滋養(yǎng)層細(xì)胞是來源于人胚胎干細(xì)胞本身。因此具有來源取材方便，在一定程度上減少了外源物質(zhì)污染的風(fēng)險等優(yōu)點。MEF細(xì)胞作為滋養(yǎng)層通常只能限定在5代以內(nèi)，否則無法很好的維持hESCs的生長，并且隨著代次增多其擴增能力減退。而從hESCs本身來源的MSCs具有干細(xì)胞的特性，可以得到大量的擴增，并且不同

25、代次之間對于維持hESCs生長沒有明顯差別。本研究從hES細(xì)胞在SCID-beige小鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤中分離得到了MSCs,考慮到畸胎瘤的生長所需要的養(yǎng)份均由鼠提供，當(dāng)畸胎瘤生長到一定大小時還有可能出現(xiàn)血管。因此在分離的MSCs中是否會有鼠的 MSCs存在，我們對此進(jìn)行了 MSCs的體外培養(yǎng)和大量的核 型鑒定，證明該 MSCs確實是來源于人，而沒有混入鼠的MSCs?？傊覀冏C明了來源于 hES細(xì)胞體內(nèi)分化而來的 MSCs能夠作為滋養(yǎng)層支持 hESCs 的生長和維持其未分化狀態(tài)，但具體機制及對hESC的長期影響尚需進(jìn)一步研究。我們的工作為獲取MSCs提供了一個新的途徑，為hES細(xì)胞培養(yǎng)中滋養(yǎng)

26、層細(xì)胞的來源提供了一個新的思路。參考文獻(xiàn)1 Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro S，et a1. Embryonic stem cell fines derived from human blastocysts J . Science, 1998. 282(5391): 1145-1147.2 Matin MJ, Muotri A, Gage F, et al. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid J. Nat Med, 2005, 11(2): 22

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