腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-17A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞作用的生物信息學(xué)分析

1、    腫瘤壞死因子-和白細(xì)胞介素-17a對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞作用的生物信息學(xué)分析    邱志偉 梅陽(yáng)陽(yáng) 仲衛(wèi)紅 付長(zhǎng)龍 謝新宇 牛曉敏 葉銀燕【摘 要】目的：利用生物信息學(xué)方法分析腫瘤壞死因子-（tnf-）和白細(xì)胞介素-17a（il-17a）對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細(xì)胞的作用機(jī)制。方法：從geo數(shù)據(jù)庫(kù)中下載gse93720基因芯片數(shù)據(jù)集，利用geo2r篩選出差異表達(dá)基因。用david 6.8在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行g(shù)o分析和kegg信號(hào)通路分析，string數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)間相互網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化編輯

2、，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，然后用mcode插件進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析。結(jié)果：共篩選出差異表達(dá)基因256個(gè)，其中上調(diào)基因213個(gè)，下調(diào)基因43個(gè)。差異最顯著的5個(gè)基因是c15orf48、cxcl8、ccl20、cxcl3、cxcr4。上調(diào)的差異基因go分析主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子活性、趨化因子活性等。上調(diào)的差異基因kegg信號(hào)通路分析主要涉及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。結(jié)論：利用生物信息學(xué)方法分析tnf-和il-17a誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化，為探究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制提供指導(dǎo)?！娟P(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;腫瘤壞死因子

3、-;白細(xì)胞介素-17a;成纖維樣滑膜細(xì)胞;生物信息學(xué)【abstract】objective：to analyze the mechanism of tnf- and il-17a on fibroblast-like synoviocytes in patients with osteoarthritis by bioinformatics.methods：microarray data set gse93720 was downloaded from the geo database and deferentially expressed genes were screened by geo

4、2r.go analysis and kegg signal pathway analysis of deferentially expressed genes were carried out using the online database david 6.8.the inter protein network was constructed by string database.the core genes in the network were screened out by using the software of cytoscape 3.7.1.then the sub net

5、work module was analyzed by plug-in mcode.results：a total of 256 differentially expressed genes were screened，including 213 up-regulated genes and 43 down-regulated genes.the five genes with the most significant difference were c15orf48，cxcl8，ccl20，cxcl3 and cxcr4.the go analysis for the up-regulate

6、d differential genes mainly involved immune response，inflammatory response，signal transduction，cytokine activity and chemokine activity.the kegg signaling pathway analysis for the up-regulated differential genes mainly involves cytokine-cytokine receptor interaction，tumor necrosis factor signaling p

7、athway and chemokine signaling pathway.conclusion：the analysis of the gene expression profile of fibroblast-like synoviocytes in osteoarthritis induced by tnf- and il-17a by bioinformatics method can provide guidance for exploring the pathogenesis of osteoarthritis.【keywords】 osteoarthritis;tnf-;il-

8、17a;fibroblast-like synoviocytes;bioin-formatics骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，oa）是臨床上最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為疼痛、關(guān)節(jié)軟骨退變、結(jié)構(gòu)變化，以及功能下降。本病受體質(zhì)量、外傷、年齡、性別、基因、環(huán)境等多種因素影響1-2，60歲以上人群患病率為24%，其中女性是男性的3倍3。oa難以徹底治愈且易反復(fù)，對(duì)患者造成很大的困擾。以往的研究發(fā)現(xiàn)，滑膜在oa中發(fā)揮著重要的作用4，在oa發(fā)病過(guò)程中，滑膜細(xì)胞大量增生，滑膜顯著增厚。滑膜細(xì)胞分為a、b兩型，a型包括巨噬細(xì)胞樣具有吞噬功能的細(xì)胞;b型如成纖維樣滑膜細(xì)胞（fls），主要功能是分泌透明質(zhì)

9、酸，為關(guān)節(jié)提供潤(rùn)滑和營(yíng)養(yǎng)作用。此外，fls還可產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子、趨化因子以及細(xì)胞因子如核轉(zhuǎn)錄因子b受體活化因子配體（rankl），促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和軟骨破壞，參與oa的發(fā)病機(jī)制5-6。腫瘤壞死因子-（tnf-）是造成關(guān)節(jié)炎軟骨破壞的重要因子，可誘發(fā)基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素進(jìn)而影響軟骨的破壞，也可通過(guò)調(diào)節(jié)fls的神經(jīng)生長(zhǎng)因子影響oa患者的關(guān)節(jié)疼痛，因此，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的治療中7-8。白細(xì)胞介素-17（il-17）是介導(dǎo)oa的一種重要炎性因子，阻斷il-17信號(hào)通路可有效緩解疼痛9。il-17家族可分為6個(gè)亞型，il-17a在其中占主導(dǎo)作用10。il-17介導(dǎo)的炎癥可導(dǎo)致fls線(xiàn)粒體功能障

10、礙，進(jìn)而刺激炎性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)11。tnf-和il-17a在oa的發(fā)展過(guò)程中均扮演重要角色，且相關(guān)研究證明這兩者之間有協(xié)同作用。例如，il-17a和tnf-可通過(guò)對(duì)成骨基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bmp-2）、wnt5a和runx2的影響，誘導(dǎo)fls向成骨細(xì)胞分化12。fischer等13發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合阻斷il-17a和tnf-對(duì)于抑制細(xì)胞因子、趨化因子以及阻止oa的發(fā)展更有效。本研究通過(guò)選取經(jīng)過(guò)tnf-和il-17a聯(lián)合處理的oa患者fls芯片，利用生物信息學(xué)方法分析該基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，探究tnf-和il-17a聯(lián)合作用于oa患者fls作用的分子機(jī)制，為未來(lái)oa的臨床治療提供方向和證據(jù)。1 材料和方法

11、1.1 geo基因芯片數(shù)據(jù)的獲取 geo是一個(gè)龐大的公共基因數(shù)據(jù)集存儲(chǔ)庫(kù)，儲(chǔ)存著眾多的基因數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的原始系列和來(lái)源平臺(tái)14。從該數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因芯片數(shù)據(jù)集gse93720，該數(shù)據(jù)集基于affymetrix human genome u133 plus 2.0 array平臺(tái)，包括2例oa和2例ra患者的fls，取自美國(guó)brigham and womens hospital滑膜切除術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)后丟棄的組織中分離出的fls，共有48個(gè)樣本（包括未經(jīng)處理、tnf-單獨(dú)處理，以及tnf-和il-17a共同處理的樣本），為了分析tnf-和il-17a聯(lián)合作用對(duì)oa發(fā)生發(fā)展的影響，取6個(gè)oa-fl

12、s未經(jīng)處理樣本作為對(duì)照組，6個(gè)tnf-和il-17a共同處理的樣本作為實(shí)驗(yàn)組。該樣本第1天在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的培養(yǎng)基中，以每孔50 000個(gè)細(xì)胞的速度培養(yǎng)。第2天用含體積分?jǐn)?shù)為1%的胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行血清饑餓。第3天對(duì)照組不受刺激，實(shí)驗(yàn)組tnf-（1 ng·ml-1） + il-17a（1 ng·ml-1）刺激約20 h，之后用trizol試劑（life technologies）收集樣本。該芯片的平臺(tái)文件為gpl570。1.2 差異基因的篩選 基因表達(dá)分析工具geo2r是基于r語(yǔ)言應(yīng)用t檢驗(yàn)或者方差分析尋找差異表達(dá)基因（degs）的軟件，利用geo2r（ht

13、tp：//geo/geo2r）對(duì)2組fls基因進(jìn)行差異分析，篩選出degs，并且設(shè)置篩選范圍為p < 0.05，差異倍數(shù)|log2fc| 2。1.3 功能富集分析 注釋分析工具david 6.8（https：/）在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)degs進(jìn)行基因本體（go）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（kegg）信號(hào)通路分析，go分析包括生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。富集分析過(guò)程中，校正p < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.4 蛋白-蛋白相互作用（ppi）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 基于string數(shù)據(jù)庫(kù)（https：/string

14、-/）構(gòu)建ppi網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)cytoscape 3.7.1軟件獲取ppi網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。2 結(jié) 果2.1 degs篩選結(jié)果 通過(guò)geo2r對(duì)gse93720進(jìn)行篩選，首先去除沒(méi)有g(shù)ene symbol注釋的條目，并設(shè)置篩選范圍為p < 0.05，差異倍數(shù)|log2fc|2。篩選后，由于探針和基因可能出現(xiàn)一對(duì)多與多對(duì)一的關(guān)系，當(dāng)一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)基因時(shí)，說(shuō)明探針不能特異定位到某個(gè)基因上，不能說(shuō)明是某個(gè)特定基因的表達(dá)量，因此刪除;當(dāng)多個(gè)探針對(duì)應(yīng)一個(gè)基因時(shí)，取這些探針的均值作為基因的最終表達(dá)值。同樣，在geo數(shù)據(jù)庫(kù)中下載矩陣文件，將探針名轉(zhuǎn)化為基因名，取重復(fù)基因探針的均值，為繪制聚類(lèi)

15、分析熱圖做準(zhǔn)備。共篩選出差異表達(dá)基因256個(gè)，其中上調(diào)基因213個(gè)，下調(diào)基因43個(gè)。上調(diào)的degs中，差異最顯著的5個(gè)基因有c15orf48、cxcl8、ccl20、cxcl3、cxcr4。利用r語(yǔ)言對(duì)degs構(gòu)建火山圖和熱圖，如圖1、圖2。2.2 degs的go分析和kegg通路分析 取上調(diào)基因進(jìn)行g(shù)o分析和kegg通路分析，選取最顯著的前5個(gè)，包括生物學(xué)過(guò)程：免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、rna聚合酶啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)病毒的防御反應(yīng)。細(xì)胞組分：細(xì)胞質(zhì)、等離子體膜、細(xì)胞外空間、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外區(qū)域。分子功能：蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體結(jié)合、趨化因子活性。見(jiàn)表1。上調(diào)差異基因

16、的kegg通路分析主要集中在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、tnf信號(hào)通路、甲型流感、趨化因子信號(hào)通路、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，ra）等。見(jiàn)表2。2.3 degs的ppi網(wǎng)絡(luò)建設(shè) 將篩選出的256個(gè)差異基因上傳到string在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到差異基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，將該ppi網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape 3.7.1中進(jìn)行可視化，網(wǎng)絡(luò)共有204個(gè)節(jié)點(diǎn)和1613條邊，見(jiàn)圖3。用cytohubba 插件計(jì)算ppi網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值（degree），選取度值最高的5個(gè)當(dāng)作核心基因，分別是il-6、cxcl10、il-1、ccl8和tlr2，關(guān)系網(wǎng)見(jiàn)圖4。

17、mcode插件對(duì)ppi網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行子模塊分析，模塊得分最高的有2個(gè)，見(jiàn)圖5。分別是模塊一30.3分，32個(gè)節(jié)點(diǎn)，470條邊。模塊二19.5分，22個(gè)節(jié)點(diǎn)，205條邊。2個(gè)模塊的基因均為上調(diào)基因。3 討 論在oa發(fā)病過(guò)程中滑膜產(chǎn)生炎癥且繼發(fā)增生，fls作為滑膜的主要組成部分，大量存在于增生的滑膜組織中，加速關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)軟骨的破壞，與oa的發(fā)展緊密相關(guān)。以往的研究表明，il-17a與tnf-皆可促進(jìn)滑膜炎癥的發(fā)展，且兩者有協(xié)同作用。本研究通過(guò)geo數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出gse93720基因芯片，利用生物信息學(xué)方法把oa患者fls經(jīng)過(guò)tnf-和il-17a處理與未經(jīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，篩選出差異基因256個(gè)，包括上

18、調(diào)的213個(gè)和下調(diào)的43個(gè)。上調(diào)的degs中，差異最顯著的5個(gè)基因有c15orf48、cxcl8、ccl20、cxcl3、cxcr4。有研究表明，cxcl8對(duì)oa患者軟骨細(xì)胞具有促炎作用;cxcl8可通過(guò)增強(qiáng)其他炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，加重oa進(jìn)程15。guan等16發(fā)現(xiàn)，ccl20在oa患者滑膜液中的水平與k-l分級(jí)呈顯著相關(guān);且ccl20可通過(guò)ccr6激活關(guān)鍵的信號(hào)通路，促進(jìn)fls中促炎性介質(zhì)的合成，可將抗ccl20作為oa藥物治療研究的潛在目標(biāo)17。cxcl3作為強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化因子，在oa中表達(dá)增加18，fls產(chǎn)生大量的趨化因子（包括cxcl8和cxcl3），參與了滑膜組織炎癥

19、細(xì)胞的浸潤(rùn)19。cxcr4參與了基質(zhì)細(xì)胞衍生因子誘導(dǎo)的oa-fls中il-6的表達(dá)20，且基質(zhì)細(xì)胞衍生因子與cxcr4相互作用會(huì)導(dǎo)致軟骨變性，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)損傷21。說(shuō)明tnf-和il-17a作為oa發(fā)展過(guò)程中重要的促炎因子，主要通過(guò)激活趨化因子促進(jìn)fls中炎性介質(zhì)的合成，進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨的變性以及關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)。go分析顯示，fls相關(guān)基因除了與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)外，還可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)識(shí)別周?chē)h(huán)境的各種信號(hào)，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)的分子活性以及細(xì)胞的某些代謝過(guò)程，甚至影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡。分子功能包括蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性和趨化因子活性等。kegg信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)差異基因主要參與了

20、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、tnf-信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。cai等22通過(guò)對(duì)比oa和ra患者fls的差異基因，發(fā)現(xiàn)oa和ra的發(fā)展中均有tnf-信號(hào)通路和趨化因子通路的參與，且tnf-信號(hào)通路主要參與oa的發(fā)展，與本研究的結(jié)論相似。說(shuō)明在il-17a和tnf-的影響下，細(xì)胞因子之間相互作用，oa-fls中tnf-信號(hào)通路和趨化因子通路被激活，通過(guò)大量趨化因子如cxcl8、ccl20、cxcl3、cxcr4，促使fls釋放更多炎性因子，加快滑膜炎癥的發(fā)展。在差異基因ppi網(wǎng)絡(luò)中利用cytohubba插件得出5個(gè)度值最高的核心基因：il-6、cxcl10、il-1、cxcl8和tlr2

21、。已經(jīng)有大量研究表明，il-6和il-1是參與oa軟骨退行性變的重要炎性細(xì)胞因子。pearson等23發(fā)現(xiàn)，oa軟骨細(xì)胞和fls之間具有交互作用，fls分泌il-6是由軟骨細(xì)胞來(lái)源的il-6誘導(dǎo)產(chǎn)生的。在oa患者的滑膜液和fls中il-6過(guò)表達(dá)，il-6濃度與oa的放射學(xué)嚴(yán)重程度和基質(zhì)金屬蛋白酶水平相關(guān)24-25。il-1由滑膜中的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激滑膜細(xì)胞降鈣素樣受體的表達(dá)，誘導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致oa產(chǎn)生疼痛26。il-1也可刺激fls產(chǎn)生外泌體，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變和軟骨退化27。mcgarry等28證明激活toll樣受體（tlr2）可導(dǎo)致ra-fls的線(xiàn)粒體功

22、能障礙，影響線(xiàn)粒體呼吸功能與細(xì)胞的代謝活動(dòng);與il-17a共同影響線(xiàn)粒體功能，促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)11。rankl是在fls上表達(dá)的細(xì)胞因子，可激活破骨細(xì)胞，造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷，tlr2可增加由il-17介導(dǎo)的rankl表達(dá)，進(jìn)一步加深關(guān)節(jié)炎癥與軟骨的破壞6，29。綜上所述，tnf-和il-17a共同作用于oa患者fls，主要是通過(guò)上調(diào)il-6、il-1等炎性細(xì)胞因子以及大量的趨化因子如cxcl8、ccl20、cxcl3、cxcr4加重軟骨退行性變和滑膜炎癥，從而加深oa的病情發(fā)展。未來(lái)oa治療可針對(duì)tnf-和il-17a的抑制，或者阻斷兩者之間的聯(lián)系作為研究方向。但本文尚存在不足之處，例如篩選

23、差異表達(dá)基因來(lái)源的樣本量較少，且樣本源自于美國(guó)oa患者，與國(guó)內(nèi)oa患者存在一定的種族差異，今后需要獲取更多的國(guó)內(nèi)樣本進(jìn)行驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)1 johnson vl，hunter dj.the epidemiology of osteoarthritisj.best pract res clin rheumatol，2014，28（1）：5-15.2 zengini e，finan c，wilkinson jm.the genetic epidemiological landscape of hip and knee osteoarthritis：where are we now and where

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