通過性腺形狀和顏色鑒定紅鰭東方純的性別-畜牧漁業(yè)論文

1、通過性腺形狀和顏色鑒定紅鰭東方純的性別畜牧漁業(yè)論文通過性腺形狀和顏色鑒定紅鰭東方純的性別孫賽紅，王玉芳，姜志強(qiáng)，仇雪梅，王秀利（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023 ）摘要：隨機(jī)采集體長(zhǎng)18 20 cm、體重200 250 g的紅鰭東方魚屯takifugu rubripes ）44尾，解剖觀察并記錄性腺組織外觀,然后利用組織切片技術(shù)鑒定 個(gè)體的性別。結(jié)果表明：性腺為細(xì)長(zhǎng)條狀且呈乳白色的個(gè)體為雄性個(gè)體，而性腺 為袋狀且呈淡紅色的個(gè)體為雌性個(gè)體，且樣本群體中的雌雄性別比例為1 : lo 本硏究結(jié)果為通過性腺外觀形狀和顏色即可準(zhǔn)確鑒定體長(zhǎng)為20 cm左右的紅鰭 東方鯽的性別提供了參考依據(jù)

2、。關(guān)鍵詞:紅鰭東方鯽；性別鑒定；性腺形狀和顏色；組織切片技術(shù)紅鰭東方純主要分布于中國(guó)的黃渤海和日本海。由于其特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和鮮 美的味道，紅鰭東方鯽一直深受中國(guó)、日本和韓國(guó)等人民的喜愛1。近年來， 人們不斷開發(fā)利用紅鰭東方魚屯，對(duì)它的硏究也越來越多樣化。性別鑒定技術(shù)在紅鰭東方鯽乃至整個(gè)魚類的種群資源保護(hù)和增養(yǎng)殖方面具 有重要作用。目前性別鑒定的方法主要有熒光原位雜交（fish ）、組織切片技術(shù)、 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr ）和aflp分子標(biāo)記等，它們已在哺乳動(dòng)物和魚類的性別 鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用。部分養(yǎng)殖魚類的生物學(xué)性狀（如成熟年齡、繁殖方式、 體色、體型、個(gè)體大小）在雌雄魚之間存在較大差異，

3、便于區(qū)分。然而，在非繁 殖季節(jié)，紅鰭東方純卻沒有明顯的雌雄外部特征，所以，對(duì)其雌雄的鑒別以及性 腺發(fā)育階段的區(qū)分較為困難。尤其對(duì)于某些硏究，例如對(duì)于需做紅鰭東方純不同 性別不同組織器官的差異表達(dá)等研究時(shí)，前述的分子生物學(xué)方法的過程略顯繁 瑣，故急需找到更簡(jiǎn)單、明了、準(zhǔn)確的性別判定法。通過觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非繁殖 季節(jié)的紅鰭東方鯽，其性腺外觀一種表現(xiàn)為袋狀，且顏色淡紅，而另一種表現(xiàn)為 長(zhǎng)條狀，呈乳白色。本硏究采用組織切片技術(shù)2進(jìn)行分析以發(fā)現(xiàn)雌雄性腺外觀 的客觀差別和規(guī)律。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料紅鰭東方純采自大連天正實(shí)業(yè)有限公司，共采集44尾。體長(zhǎng)為18-20 cm , 體重為200250 g。1

4、.2試劑無水乙醇、二甲苯、苦味酸、甲醛 酸水、堿水、蘇木精伊紅染液、甘油蛋 白、中性樹膠、高級(jí)切片石蠟等試劑和藥品來自大連海洋大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室。1.3儀器烘箱、切片機(jī)（leicarm 2235 顯微鏡(leica dm 2000 )和烘片機(jī)（leica hi 1220 ）等。1.4方法解剖紅鰭東方鯽，觀察性腺形狀和顏色。按叢玉婷、唐洪玉、梁春光和戴奇 等25方法制作組織切片。141固定、脫水、透明取性腺于bouin氏固定液中固定24 h后，每隔2 h、4h、6h、12 h. 24 h換一次70%乙醇，洗去滲入組織內(nèi)部的固定劑；然后將 洗滌好的樣品用酒精梯度（70%、80%、90%、95%、1

5、00% ）依次脫水,每次 35-45 min ,除去組織內(nèi)含有的大量水分；1/2無水乙醇和1/2二甲苯作用30min ,二甲苯作用15 min置換岀組織內(nèi)的脫水劑至組織塊完全透明。1.4.2包埋、滲蠟、切片石蠟融化后，將組織塊置于含1/2二甲苯和1/2石 蠟的小瓶子滲透30 min然后在純石蠟中滲透40 min純石蠟再次滲透30 min ; 將紙片疊成盒狀，倒上融化好的石蠟，然后把滲好蠟的組織塊放入盒中間，待蠟 凝固；把凝固的蠟塊修成適合大小,固走于切片機(jī)上，切片；取較好的切片挑在 事先涂少許甘油蛋白和蒸f留水的載玻片上展片,于烘干機(jī)上烘干水分。1.4.3染色首先脫蠟，二甲苯脫蠟15 min

6、,換新的二甲苯再次脫蠟15 min ; 然后降水z 100%乙醇i、100%乙醇ii、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70% 乙醸50%乙醇、30%乙醇、h2o依次降水2 min ;蘇木精染液著色10 min , 自來水沖洗5 min ;1%鹽酸酸化5 s，水洗3 min ;1%氨水藍(lán)化5 s，水洗3 min ; 脫水：30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇依次脫水2 min; 伊紅染色液著色5 min ; 95%乙醇、100%乙醇i、100%乙醇ii脫水2 min ; 二甲苯透明10 min z換新的二甲苯透明10 mino1.4.4封片、觀察將透明結(jié)束的載玻片從二甲

7、苯中取出，在切片中央滴一滴 中性樹膠，然后用銀子輕輕蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，于leica dm 2000 顯微鏡下觀察紅鰭東方鯽性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)。2結(jié)果通過對(duì)44尾紅鰭東方鯽性腺外觀的觀察,發(fā)現(xiàn)其性腺形狀和顏色可分為兩 種：一種為袋狀淡紅色，見圖1 ；另一種為長(zhǎng)條狀乳白色，見圖2。它們對(duì)應(yīng)的 組織切片結(jié)果分別為圖3和圖4。圖3為紅鰭東方魚電處于第期的卵巢切片，此 時(shí)初級(jí)卵母細(xì)胞處于小生長(zhǎng)期，細(xì)胞質(zhì)為嗜堿性，細(xì)胞核中核仁靠近核膜內(nèi)側(cè)分 布6。圖4為雄魚的精巢切片，圖中可明顯看到精母細(xì)胞和染成深色的精子6。本硏究有22尾魚的性腺外觀表現(xiàn)為袋狀、淡紅色，為雌性個(gè)體；22尾魚的性腺外觀表現(xiàn)為長(zhǎng)條狀、乳白

8、色，為雄性個(gè)體。纟璘東方純的雌、雄酬比例為1:1圖1袋狀淡紅色性腺圖2長(zhǎng)條狀乳白色性腺圖3雌性性腺組織切片4雄性性腺組織切片3討論早期的性別鑒走法主要是染色體核型分析法、組織切片法、hy抗原檢測(cè)法 和x染色體酶活性檢測(cè)法等7。20世紀(jì)80年代后期,分子生物學(xué)方法開始應(yīng) 用于哺乳動(dòng)物胚胎性另啲鑒定，其具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度。隨著魚類性 別決定相關(guān)基因如dmy、dmrt1. sox、tra2等9j0基因的發(fā)現(xiàn)，魚類分 子生物學(xué)性別鑒定技術(shù)也相繼發(fā)展起來，有多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr )擴(kuò)增雄性染 色體特異基因、熒光原位雜交(fish和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna( rapd mil-13 方法。通過觀察發(fā)現(xiàn)

9、，對(duì)于非繁殖季節(jié)的紅鰭東方軌,其，注腺外觀有兩種：一種為袋狀淡紅色，另一種為長(zhǎng)條狀乳白色，推測(cè)具有袋狀淡紅色性腺的個(gè)體為雌性個(gè)體，具有長(zhǎng)條狀乳白色性腺的個(gè)體為雄性個(gè)體。本研究采用組織切片技術(shù)進(jìn)行分 析鑒定此客觀差別和規(guī)律。利用組織切片法已對(duì)牙鉀、斑馬魚、暗紋東方鯽、石 鰥、長(zhǎng)江刀魴、黃穎魚、大彈涂魚、半滑舌觴等魚的性腺發(fā)育過程進(jìn)行了研究。潘彬斌14用組織切片法觀察三角帆蚌性腺各時(shí)期發(fā)育；王晶等15利用組織切 片法研究斑馬魚性腺發(fā)育過程,找到了斑馬魚的性別分化和性腺分化過程；王文 君等16用組織切片法觀察了石鰥仔、幼魚性腺發(fā)育過程。這些研究都表明利用 組織切片的方法可清晰辨別性腺類型，即通過組織

10、切片得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確可 靠的。本研究利用組織切片技術(shù)證明了體長(zhǎng)20 cm左右的紅鰭東方鯽性腺為袋狀淡紅色的個(gè)體全部為雌性個(gè)體，性腺為長(zhǎng)條狀乳白色的個(gè)體全部為雄性個(gè)體。對(duì)于需要采集體長(zhǎng)為20 cm左右的紅鰭東方鯽不同的組織器官進(jìn)行相關(guān)研究” 又需要知道準(zhǔn)確的性別來講，今后可通過解剖觀察其性腺的形狀和顏色，即可準(zhǔn) 確判定其雌或雄的性別z不必再用其他任何方法進(jìn)行鑒定。通過解剖觀察性腺的 形狀和顏色判定性別,該方法簡(jiǎn)單、明了、準(zhǔn)確。參考文獻(xiàn)：1馬愛軍，陸麗君，陳超，等.東方純屬主要經(jīng)濟(jì)魚種繁育養(yǎng)殖、育種和 基因研究現(xiàn)狀j 海洋科學(xué)，2011, 35(11) : 128-1302叢玉婷.生物切片技術(shù)

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