β-內酰胺酶在肝細胞肝癌中的表達及臨床意義

1、B-內酰胺酶在肝細胞肝癌中的表達及臨床意義背景肝細胞肝癌 (Hepatocellular Carcinoma,HCC) 簡稱為肝癌 , 是消化系統(tǒng) 最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤。相關調查顯示 , 每年約有 100 萬新發(fā)的肝細胞肝癌 的病例被檢測出來 ,其中, 超過三分之二的新病例分布在西太平洋地區(qū) 1 。肝細胞肝癌的死亡率居全球第二位 ,最新研究數(shù)據(jù)顯示 , 在全世界由惡性腫 瘤造成的死亡事件中,肝細胞肝癌所占的比例最高2。HCC具有起病隱匿、高度 惡性和快速進展的特征，且HCC患者的早期診斷仍是一個尚未被攻克的巨大挑戰(zhàn)。大多數(shù)患者在腫瘤已發(fā)展為晚期時才得到明確診斷，而HCC勺常用治療方案 如外

2、科切除、 肝移植、射頻消融等手術治療的禁忌癥較多 , 因此, 通過上述手術療 法來達到根治肝癌的目標的幾率很低3,4。有研究顯示HCC治療后的1年總體 生存率較為良好 ,為 66.1%,而 3年、 5年總體生存率則分別降至 39.7%和 32.5%; 在早期HCC患者中分別為93.5%、70.1%和59.1%5。但由于缺乏靈敏的早期診斷方法,HCC的病死率依然很高。鑒于目前 HCC臺 療方法尚未被攻克的局限性，確定HCC發(fā)生的分子機制并開發(fā)新的早期診斷和預 后預測策略至關重要。越來越多的證據(jù)表明，代謝失調尤其是異常脂質代謝在包括 HCC在內的腫瘤 進展中發(fā)揮著巨大作用6-9。B -內酰胺酶(b

3、eta-lactamase,LACTB)主要位于哺 乳動物有核細胞的線粒體內 , 在人體的不同組織中普遍存在 ,特別是在骨骼、心臟、 肌肉和肝臟。作為哺乳動物活性位點絲氨酸蛋白丄ACTB與細菌青霉素結合蛋白在進化上 相關。LACTE可作為線粒體內膜組織和能量穩(wěn)態(tài)的調節(jié)因子參與脂質代謝的調節(jié) ， 繼而抑制腫瘤進展 , 同時作為細胞代謝過程的新型蛋白酶同源物起作用 10此外,研究表明LACTB在一些惡性腫瘤如乳腺癌11、膠質瘤12、胃癌13 和結直腸癌14,15中的表達低于癌旁組織,過表達LACTB可以抑制腫瘤細胞的 增殖。以上研究表明LACTB可作為一種新型的表觀遺傳沉默腫瘤抑制因子，在腫 瘤的

4、進展中發(fā)揮著重要作用。然而丄ACTB在HCC中的表達情況和功能作用在很大程度上仍未被探索。目 的1.探究LACTB在肝細胞肝癌中表達水平的具體情況：分析TCGA數(shù)據(jù)庫中 LACTB mRN在肝癌及癌旁組織中的轉錄水平是否有差異，以及LACTB mRN轉錄 水平與肝癌患者TNM分期、病理學分級和整體生存率(Overall survival rate,OSR)的相關性；探究LACTB在鄭州大學隊列的肝癌及癌旁組織中的表達 水平是否有差異，以及LACTB表達水平與肝癌患者TNM分期、病理學分級和整體 生存率的相關性;2.探究過表達LACTB寸肝癌細胞的表型的影響：體外過表達 LACTB寸肝癌細胞的增

5、殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響；體內實驗驗證過表達LACTB寸裸鼠成瘤能力的影響。方法:1.下載TCGA(the cancer genome atlas) 數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的臨床信 息以及LACTB mRN轉錄水平相關數(shù)據(jù)進行篩選和整合，分別分析LACTB mRN在 肝癌及配對的癌旁組織中的轉錄水平，及LACTB mRN轉錄水平與肝癌患者TNM 分期、病理學分級和總生存率的相關性。 2. 選取 341 例肝細胞肝癌患者的組織標 本,這些患者于 2011年至2015年就診于鄭州大學第一附屬醫(yī)院 ,且經過病理診斷 確診為肝癌。利用這些標本構建組織微陣列 (Tissue microarray,TM

6、A) 備用。 3. 采取免疫 組織化學(Immunohistochemical,IHC)染色法檢測臨床組織樣本中 LACTE蛋白質 表達水平,并分析肝癌組織中LACTB表達水平與患者的臨床病理特征的相關性及其對肝癌預后的影響4.利用慢病毒轉染技術過表達LACTB并經蛋白印跡方法確認后,采取CCK-8 實驗、EdU染色實驗和克隆形成實驗檢測肝癌細胞的增殖能力，采取細胞劃痕實 驗和Tran swell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力。5.采用表達LACTB的肝癌 細胞注射到裸鼠皮下 , 利用活體成像儀記錄皮下腫瘤的生長速度 ,6 周后處死小 鼠取出腫瘤,并利用IHC方法檢測LACTB及 Ki-67

7、的表達情況。6.采用GraphPadPrism軟件(7.0版)和SPSS軟牛(版本23.0)分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。 采用卡方檢驗來檢測LACTB表達水平與肝癌患者臨床病理學特征的相關性,采用 t檢驗用于比較組間差異；采用Kaplan-Meier生存分析探究不同的LACTB表達水 平對肝癌預后的影響。結果:1.TCGA分析結果顯示,LACTB mRN碓肝癌組織中的表達水平比正常組 織明顯降低;LACTB的表達水平在具有高病理學分級的患者中顯著低表達 ，而在 不同TNM分期的患者中LACTB勺表達水平則未表現(xiàn)出明顯的差異。2.Kaplan-Meier分析顯示LACTB氐表達的肝癌患者總體存活率(Overa

8、ll survival,OS)和無復發(fā)生存率(Relapse-free survival,RFS)顯著低于 LACTB高表達的患者。GSEA分析結果顯示,與肝癌患者生存負相關的基因顯著富集于 LACTB低表達 組，相反,與肝癌存活正相關的基因顯著富集于 LACTB高表達組。3.免疫組化染色 結果顯示肝癌組織中LACTB蛋白表達水平顯著低于配對的癌旁組織;LACTB表達 在TNM分期1-11和III-IV 之間存在顯著差異，并且在高TNM分級的組織中表達 更低。4.LACTB低表達的肝癌患者總體存活率(OS)顯著低于LACTB高表達的患者 由單、多因素分析可知，低表達LACTE和高級別TNM分期是肝癌患者獨立預后危 險因素。5.體外細胞實驗的結果顯示,過表達LACT列以顯著抑制肝癌細胞在體外的 增殖、遷移及侵襲能力。6.體內實驗結果顯示,過表達LACTB寸于肝癌細胞在體