丹參的多種鑒別方法

1、丹參的多種鑒別方法(總10頁)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One 1CAL本頁僅作為文檔封面使用請(qǐng)直接刪除丹參單身的多種鑒別方法【摘要】：通過檢索相關(guān)的文獻(xiàn)，分別從植物形態(tài)、植物分類，顯微特征，以及薄層 層析法、紫外光譜鑒別法及指紋圖譜、分子 生物學(xué)等方面對(duì)丹參進(jìn)行鑒別區(qū)分，進(jìn)而對(duì)丹參進(jìn)行質(zhì)量控制?！娟P(guān)鍵詞】：丹參；鑒別(Abstract :ln recent years d if fere ntplantswhose roots are the same likeSalviamiltiorrhizaBge roots are being used author

2、s summarized the recent research on distinguishingSalviamiltiorrhizaBge roots in d iff ere ntkinds ofways. Themethodsinclude: plantmorphology, plant classification, root trait identification, water logging identification, powdermicroident訐icationzthin layer chromatography, ultravioletspectrum identi

3、fication, fingerprint identification, DNA geneticmarker identification aswellasRAPD identification. Thesemethods have been used in differentiating the realSage roots and the false ones. After the processitmay easily control the quality of the Sage rootsKey words :Salvia miltiorrhizaBge; Identificati

4、on丹參Salvia miltiorrhizaBge.為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)植物,是常用中 藥之一。藥用其根，因其根皮赤而肉紫且形狀似參而得名“丹參” O丹參作為傳 統(tǒng)中藥在我國沿用已久，我國最早的藥書神農(nóng)本草經(jīng)即收載有丹參，列為上品' 中醫(yī)理論認(rèn)為丹參有祛淤止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效。1丹參形態(tài)學(xué)鑒別1.1植物學(xué)特性鑒別傳統(tǒng)方法大多根據(jù)丹參的形態(tài)方面對(duì)藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行 別。丹參為多年生草本，根磚紅色，莖高40-80 cm,多分枝，被長柔毛。葉常為奇數(shù) 羽狀復(fù)葉。葉柄長1-7 cm,小葉37,頂端小葉較大。小葉卵形或橢圓狀卵形。長 1. 58 cm,寬0

5、. 85cm,先端鈍，邊緣具圓鋸齒兩面被柔毛，下面較密'花序頂生或腋 生輪傘花序有花6至多花，組成假總狀花序,密被腺毛及長柔毛;小苞片披針形;花 萼鐘狀，長1-1. 3 cm,先端二唇形，萼筒喉部密被白色柔毛;花冠藍(lán)紫色，二唇形，長 2-2. 7 cm,花冠筒外伸，彎曲上長達(dá)2 cm,筒內(nèi)有毛環(huán);雄蕊2,藥隔長，花絲短，上臂 藥室發(fā)育,2下臂的藥室不育且聯(lián)合;小堅(jiān)果4,橢圓形，花期5-8月，果期8-9月。 根據(jù)丹參的植物學(xué)特征可以將丹參與混用的藥材進(jìn)行區(qū)分。1. 2丹參藥材根部性狀鑒別丹參及其親緣種類的藥用植物其多,以根部特征區(qū) 別各類丹參也是沿用很久的經(jīng)典方法。丹參根的特征為:丹參多

6、為帶根莖的根，根 莖粗短，有莖基殘余，下著生多數(shù)細(xì)長的根。根呈圓柱形,稍彎曲，表面呈磚紅色， 粗糙，具多數(shù)縱溝或皺紋，有須根痕，外部栓皮常鱗片狀剝落,皮層有時(shí)開裂，長8-22 cm,直徑5-12 mm,質(zhì)堅(jiān)脆，易折斷，斷面不平，疏松有裂隙，皮部棕渴色或磚紅色，韌 皮部狹。形成層明顯,淡棕色，木質(zhì)部導(dǎo)管束灰黃色或黃白色,放射狀排列。氣微， 味微苦、澀，以條粗壯、色紫紅者為佳。1.3水試鑒別法：用水浸泡丹參根的方法對(duì)丹參進(jìn)行鑒別，正品丹參根浸泡后 的溶液無色，藥材稍膨脹，顏色稍微變淺。偽品丹參溶液顯紅色藥材變?yōu)榈t色。 水浸后續(xù)斷會(huì)被染成紅色，粉末中有草酸鈣簇晶;丹參水浸不染成紅色，粉末中無草 酸

7、鈣簇晶；（旦有石細(xì)胞及紅棕色物為丹參。從而將兩者進(jìn)行區(qū)分。2顯微結(jié)構(gòu)鑒別2. 1根的橫切面顯微結(jié)構(gòu)鑒別根據(jù)丹參橫切面顯微結(jié)構(gòu)特征與紫丹參進(jìn)行區(qū) 分丹參(Salvia miltiorrhizaBge.)木栓層37列木栓細(xì)胞氏方形沏向延長，壁非木 化或微木化;外側(cè)有時(shí)可見落皮層。皮層窄，纖維單個(gè)散在或2-6個(gè)成群,孔溝放 射狀，層紋細(xì)密。韌皮部較窄川I篩管群和薄壁細(xì)胞組成。形成層明顯成環(huán)。木質(zhì) 部寬廣z 4-12 mm呈放射狀排列。有些相鄰的束在內(nèi)側(cè)合并，導(dǎo)管類圓形或多角 形，有的沿徑向延長，直徑15-65 mm,單個(gè)散在或212個(gè)成群，徑向排列或切向排 列;木纖維發(fā)達(dá)，多成群分布于大導(dǎo)管周圍；有

8、的本質(zhì)部束內(nèi)有1-2群木化薄壁細(xì) 胞;木射線寬廣'射線細(xì)胞多木質(zhì)化增厚。紫丹參根莖表皮細(xì)胞1列，內(nèi)含紫紅色 物質(zhì);皮質(zhì)薄壁細(xì)胞有的具紋孔;髓部薄壁細(xì)胞壁呈連珠狀增厚或稍增厚，具紋 孔。根本質(zhì)部束常較小，導(dǎo)管也少。2.2根粉末的顯微結(jié)構(gòu)鑒別丹參粉末呈紅棕色。木栓細(xì)胞黃棕色，表面觀呈類方形或多角形，壁稍厚,胞腔內(nèi) 常含紅棕色色素，色素溶解后，斷面觀細(xì)胞類長方形，排列較整齊。木纖維多成束， 長梭形，紋孔斜裂縫狀或十字狀，孔溝稀。導(dǎo)管主要為網(wǎng)紋和具斜紋孔導(dǎo)管。石細(xì) 胞呈類圓形、類三角形、類梭形、類長方形或不規(guī)則形，也有延長呈纖維狀，有的 胞腔內(nèi)含棕色。2. 3花粉形態(tài)學(xué)特征對(duì)丹參及同屬藥用植物

9、的鑒別一定的植物具有一定形態(tài) 的花粉，因此花粉形態(tài)研究也是植物分類鑒別的依據(jù)之一。丹參的花粉以外壁較薄、紋飾網(wǎng)眼較淺、網(wǎng)脊較粗、溝較寬、溝底具顆粒而 區(qū)別于其他種。丹魯根橫切面倚圖(23理化學(xué)方法鑒別3. 1根據(jù)丹參所含的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別經(jīng)過大量分析研究說明丹參所含化學(xué) 成分中二祜釀成分與系統(tǒng)發(fā)育有密切關(guān)系，二菇醞類化合物組成的不同可以作為 種類鑒別的依據(jù),根據(jù)二菇覘成分含量的多少對(duì)丹參組作丹參的藥用植物的親緣 關(guān)系進(jìn)行劃分。3. 2薄層色譜鑒別林佳等采用薄層色譜定性鑒別的方法比較后指出在同一展 開系統(tǒng)的條件下，無論是野生還是栽培品種，丹參的一些主要成分相同，以此可以 作為識(shí)別丹參藥材真?zhèn)蔚膮?/p>

10、考依據(jù)。硅膠叫偵制閒丿丄仮(煙臺(tái)幣化學(xué)I業(yè)研究所生 產(chǎn)H期；2W4年12丿29日)樣品名稱S丹酚酸B12丹參(產(chǎn)于河北)3丹參(產(chǎn)于陜西)46丹參(產(chǎn)于山東)7,8丹參(產(chǎn)于安徽)相關(guān)條件供試品溶液：取丹參粉末.加75%甲醇25訊 加熱回流1小時(shí)，放冷.濾過，濾液濃縮至lml對(duì)照品溶液：取丹酚酸B對(duì)照品，加75%甲醇制成每lml含2mg的溶液。薄層 板：高效硅膠 GF254,預(yù)制薄層板(HPTLC-plate Nano-DLRASIL-20. UV254 MN)。點(diǎn)樣： 2pl：條帯狀點(diǎn)樣，條帶寬度為10mm.條帶間距為5mm.原點(diǎn)距底邊10mm展開劑：甲 苯三氯甲烷乙酸乙酣甲醇甲酸(2:3:

11、4:2), 20mL展開缸：雙槽展開缸,20cmxl0cm。展 開：展開缸一側(cè)槽中加入展開劑，預(yù)平衡15分鐘.上行展開，展距為8cmc檢視：迓 紫外光燈(254nm)T檢視。3.3紫外吸收光譜鑒別丹參在253, 277 nm兩處有吸收特征峰，而甘西鼠尾在264,248, 218, 203 nm 4處 有吸收特征峰。作丹參使用的藥材紫外吸收光譜的范圍不同，據(jù)此可以對(duì)兩者進(jìn) 行鑒別。丹參粉末處理后置紫外燈(365nm)下現(xiàn)察顯亮藍(lán)灰色熒光3.4紫外導(dǎo)數(shù)光譜：李海鷹等研究認(rèn)為丹參與番薯根的石油瞇、甲醇及氯仿提 取物的零階和二階導(dǎo)數(shù)光譜均可用于二者的鑒別。3. 5丹參藥材的近紅外漫反射光譜模式識(shí)別法鑒

12、別劉沐華等近紅外漫反射光 譜(NIRTDRS)模式識(shí)別法可以有效地應(yīng)用于中藥材自動(dòng)鑒別、遞歸支持向量機(jī)等 方法可以有效地完成自動(dòng)分類和特征譜段選擇。不同種丹參藥材的NIRTDRS丹 參及屬內(nèi)植物為根莖類藥材，其根莖中除含有大量的纖維素、淀粉等外，其他化學(xué) 成分主要分脂溶性的其結(jié)果與化學(xué)成分測定一致。NIRTDRS用于不同種丹參藥 材的鑒別，方法簡便、結(jié)果可鼎。指紋圖譜鑒別(HPLC法)高效液相色譜(HPLC)具有色譜穩(wěn)定性好、柱效高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)'是中藥 指紋圖譜研究中常用的手段。對(duì)丹參等兒種中藥指紋圖譜與代謝指紋圖譜研究 的結(jié)果，指出不同產(chǎn)地的藥材在指紋圖譜上存在較大差異。WAV

13、(*«rplc 曲)Vtfm -lfsmil<XM->Wuefi-XJ>Wueni KT-m»(2?耳均1hWily*1HSFgRaw0叩owo.»©0.(320咖a wowaM0 61*93制Ul)*刪0炊a妙& W0. I474滅州（沁從）0 911o m0 9IJawooio0 2445WX2<HW«2)a.wi0 W7awQ珮©w0.3156兇幵（迢siawo wo.ma 9tiiG.WQM9?a.wQ.心QXans1 <TO8云剛Y町a(chǎn). mi0. W4QW3Q9S3o.w0 M79a

14、wia 922am0.9*9o.raZ210曲賞占（匚74、ama刪QW0.0姒1II1114x( Sw4*r«)amiama«sia切©.*7a ii34分子生物學(xué)鑒別方法RAPD鑒別法：隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物種鑒別。丹參主要居群DNA指紋圖譜的建立基因組DNA的提取表1實(shí)驗(yàn)所用材料編號(hào)名稱來源花顏色Ai大葉丹參四川中江縈色a2商洛丹參陜西帝洛紫色a3苣縣紫花丹參山東苣縣紫色扎四倍體丹參中國藥科大學(xué)紫色A,苣縣白花丹參山東苣縣白色A«北京丹參中國中醫(yī)藥硏究院紫色A7亳州丹參安徽亳州紫色A?芮城丹參山西芮城紫色為江蘇丹參

15、江蘇肘陽紫色A io小葉丹參四川中江紫色Ail安國丹參河北安國紫色A12甘西鼠尾草甘肅紫色Au一串紅陜西省雜交油菜研究中心紅色An油菜陜西省雜交油菜研究中心黃色A15小麥陜西省雜交油菜研究中心注:A】A也為各居群編號(hào),詳見表1,以下同。RAPD 一 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化分別設(shè)計(jì)M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度等單因子試驗(yàn)，同時(shí) 保持?jǐn)U增體系的其它成分濃度及擴(kuò)增程序其它環(huán)節(jié)不變，以優(yōu)化、確證適宜的 M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度。結(jié)果如下：I-3>6.7-9、心12泳道TaqDNA «合析濃度分別為 OJ A7.0.9J.0 I./20 p

16、.L（引物S2O6O模板河北女卜I刃爹）BB 1 TaqDNA農(nóng)合Si濃度梯度1 2 34 56 7 8 9 1011 1213 14 15卜3 A -6J-9JO-12 J3-I5冰道 忒旅度分別為05J.0J3.Z0.2.5 ntnol/pJ. （0lftS2OO3,K« 江蘇 gWIH參）圖2 濃度拂度a 4> * 圖!tt 濃度分 9J & 1.2%. 1.5% 20%1-5泳道&10泳2i JI-15泳逍的引物分別為S2018、«O2（»2O24 >2025 .S2O29 «?皈：蚩墩老卅 N龕圖4瓊脂精換膠濃度梯度

17、J,2,3.4沐述袒板DNA鍛度分刖為30.60.90120 昭20 ilL（引物32042山州代換幵豹圖3漠扳DNA濃度梯度AHS： I-4.5-8.9-12 J3-I6J7-20.21-24 泳id Mg2濃腹分別為 I.0J.5.2.033 Bimol/L;l-4和 36泳iff退火 »& 36 T.5Y和17*20沐遵退知fiBK39 Y.412和21-24津港遇火溫度為42 口卜12誅道引物$2001424 冰逍引物S2O21 復(fù)板：曲希共花丹第B圖：1-3+6、7、9泳曲退火溫度分別為3649.42 ©引物S2OO3.按板：山西丹參B05退央溫度及子濃度

18、優(yōu)化鑒別丹參與其近緣和遠(yuǎn)緣植物的特征引物及其DNA指紋圖譜引物S2035、S222擴(kuò)增結(jié)果不僅穩(wěn)定.條帶明亮，而且釆用引物S2035、 S232建立的指紋圖譜丹參主產(chǎn)區(qū)的n個(gè)居群丹參的PCR擴(kuò)增帶型兒乎相同（1 一 n泳道），其中有200 - llOObp的七條共同的特異條帶，即圖6的條帶CI、CZ、 C3、C4、圖7的CS、C6、C7,各丹參居群完全相同。囹6鑒別丹券與其近緣及遠(yuǎn)緣植物的指紋圖譜【，引物S2035xmtw 40(知知 c»hu«t找恂緣或辺塚理物旳荷征弓|物。山 A.i 、, g A, A« An A|i Ac Afa 心. MAl Al Aj

19、As A) A? A. AAjgAii A| * A|a Ah A,X4圖7鑒別丹參與其近緣及遠(yuǎn)縊植物的捋紋圖譜D,引物S222結(jié)果驗(yàn)證：結(jié)果驗(yàn)證顯示，PCR擴(kuò)增重復(fù)性較好，取樣合理，能夠代表各居 群?？倕ST序列中SSR信息的分析及建立丹參EST序列中SSR信息的分析微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡單重復(fù)序列(Simplesequence repeat),指的是基 因組中由16個(gè)核昔酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA,廣泛分布于 基因組的不同位置，長度一般在200bp以下SsR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富，多性 高，多等位基因，共顯性，重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)建立SSR標(biāo)記的序列性質(zhì)

20、不 同可分為基因組SSR (Genomic SSR,gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR ( Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)。EST及表達(dá)序列標(biāo)簽是通過從cDNA文庫中隨機(jī) 挑選的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序所獲得的5'或3'端序列，長度一般在 150500bp。丹參EST序列中SSR信息的分析及建立表2丹參EST-SSR引物情況表引物編號(hào)Primer cixle重復(fù)基元 llr|）eat motifGeneBank EST 編廿 GeneBank l；ST code預(yù)期產(chǎn)物bpExp（x-tcd producle size引物序列Priiner 屮3

21、'）退火溫度TmCSSK（M）|（IACA）5CV172410241CiACGCTAC： 1 ICGJGCACC；52.3GAAACTAAAGCAACAAACCC52.1SSl«>02（C：A）I6CV172134176CCGTGGTGTTCCCTCTTT55TGCCGATTCTAACCTGTATG53.7SSI«M>3（CT） IdCV171877137A（；AG（；C TCC 1 <；C 1 1 SIT52.7TCAAGTCAIAGGCGTGGC54.5SSK004（AA：）6CV 171649A（；CAC；AC：A（；A：CTC：ArA46.

22、7CTTCCCACCAAAFAACTC46.8SSR.005GTG6CV 171565153C：TC：A（；C：AX2TA<：TACX：ACAT49.6CTTATCCCAACACTTCTTCI4H.5SSK006（ATC）5CV 171563155AAA（：A（；A；C；A（：GAAGCAC；56.2AC2（：A（：CAT（：ACT：AA（；AC?G56.4SSR（M）7（CTT）l 1FE537066165C：T（：CG：TTC：C；C：T：CTCTT57.7TGCTCGCTTCGTCGTCTT57.2SS1（）8（；CT）6FE53637018!AGGTTACTACCGATGAAGC

23、AG54.1AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT53.2SSK009（AA（；）6FE536230145C；A：TTT；C；ATC；CC：T；CT（：52.9（；ACGCCGCTACTTTCIAT50.2SSROId（TATCC）SFES36S72136AATAAGCCAATACACCGTC49.2CTTTACACGCATAACACG47.4SSR0I1（TC）1KFE53656I162AACTTGGCAATGTTCGCTAT55.2GCTTGTTCTTGACAGGCTTC54.9SSRO12（TC：）Sutct（AC：）XFE536456161CCTCCATTCCTCTTATTTCC5

24、2.9GCCATCAAGTGGTCGTCT55.6SSR013（AGQ6FE536096162CAGTCCAACAGCCCGACCAG63.4AT（：ATCATC：GCCACX：ATCCC62.4從NCBI數(shù)據(jù)庫下載鼠尾草屬EST序列11747條，其中包括丹參EST 序列10228條和Salvia fruti-cosa 1519條，應(yīng)用Active對(duì)含有SSR的序列進(jìn) 行搜索。搜索參數(shù)設(shè)置為：單核昔酸、二核昔酸、三核昔酸、四核昔酸、五核昔酸和六核昔酸最少重復(fù)次數(shù)分別為18次、6次、5 次、4次、4次、3次丹參的EST-SSR分布頻率與特點(diǎn)丹參EST-SSR中共包含77種重復(fù)基元。單核昔酸重復(fù)有1種A/T。二核昔酸重 復(fù)也為3利以AG/CT為主，占。三核昔酸重復(fù)為10種表3丹參EST-SSR信息情況表取貝類型Kcpcat types基兀種數(shù)Number