SIRT1在內(nèi)耳擬老化伴線粒體DNA4834缺失突變細(xì)胞模型中的作用及其機(jī)制研究

1、SIRT1在內(nèi)耳擬老化伴線粒體 DNA4834缺失突變細(xì)胞模型中的作 用及其機(jī)制研究目的：研究SIRT1基因在大鼠耳蝸組織中的表達(dá)特點(diǎn)，為離體研究奠定理論 依據(jù)。方法：分別選取新生0-3天大鼠、正常成年大鼠及5%半乳糖頸部皮下 注射8周誘導(dǎo)老化的大鼠各五只分離出雙側(cè)耳蝸組織,用OCT包埋后行耳蝸冰凍 中軸切片 , 應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測 SIRT1 在各組大鼠中的表達(dá)。結(jié)果：新生0-3天大鼠組、正常成年大鼠組及 5%半乳糖頸部皮下注射8 周誘導(dǎo)老化大鼠組耳蝸冰凍切片免疫熒光染色后均可見廣泛、明亮的綠色熒光 , 在血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、 Corti 器區(qū)域 , 熒光增強(qiáng)尤為顯著。各組間熒光強(qiáng)度無

2、 明顯差異。結(jié)論：SIRT1在大鼠耳蝸組織中廣泛表達(dá)，其表達(dá)在血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、 螺旋韌帶、Corti器尤為突出。SIRT1在新生0-3天大鼠組、正常成年大鼠組及 5%半乳糖頸部皮下注射8周誘導(dǎo)老化大鼠耳蝸組織中的表達(dá)無免疫熒光檢測 范圍內(nèi)可見明顯差異。目的：建立離體大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞 (Marginal cells, MCs) 和螺旋神 經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Spiral ganglion cells, SGCs線粒體常見缺失突變模型,為老年性聾 的機(jī)制研究提供合適的研究對象。方法：選取新生 0-3 天大鼠,剝離雙側(cè)耳蝸組 織,分離出血管紋組織和螺旋神經(jīng)節(jié)組織塊 ,分別行組織塊貼壁法和消化法培養(yǎng)

3、獲取較均一的血管紋邊緣細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。向體外培養(yǎng)的耳蝸血管紋細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中分別加入不同梯度濃度的D半乳糖,采用MTT法檢測0、2、4、6、8、10、12、14、16g/L D 半乳糖 作用48h對血管紋邊緣細(xì)胞及螺旋神經(jīng)細(xì)胞活性的影響，篩選出最適誘導(dǎo)濃度；應(yīng)用Taqman熒光探針實(shí)時定量PCR方法檢測最適濃度D半乳糖分別作用血管 紋邊緣細(xì)胞和螺旋神經(jīng)細(xì)胞 24h、72 h、120 h、168 h、216 h 后 mtDNA4834bp缺失突變的檢出率；應(yīng)用 B 半乳糖苷酶(senescence-associated B -galactosidase, SA- B -gal)染色法

4、檢測細(xì)胞衰老狀態(tài)；應(yīng)用碘化丙錠 (Propidium Iodide, PI)染色流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期；采用 Ann exin V -PI雙染流式細(xì)胞儀及TUNEI法測定細(xì)胞凋亡率；采用JC-1熒光探針染色流式細(xì)胞儀 及熒光顯微鏡計數(shù)法測定細(xì)胞線粒體膜電位變化。 結(jié)果：血管紋邊緣細(xì)胞和螺旋 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別在14g/L和10g/L D 半乳糖作用點(diǎn)出現(xiàn)濃度依賴性活性降低, 故12g/L和8g/LD半乳糖分別為MCs和SGC啲最適誘導(dǎo)濃度。12g/L D 半乳糖連續(xù)作用血管紋邊緣細(xì)胞168h后可誘導(dǎo)出較顯著的 mtDNA4834b缺失突變；細(xì)胞B半乳糖苷酶表達(dá)明顯升高；細(xì)胞分裂緩慢,細(xì) 胞周期停滯

5、于G0/G1期,S細(xì)胞及G2/M期細(xì)胞趨于消失；細(xì)胞凋亡率明顯升高； 線粒體膜電位明顯降低。8g/L D 半乳糖連續(xù)作用螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 120h后也可 誘導(dǎo)出有統(tǒng)計學(xué)意義的 mtDNA4834b缺失突變,TUNEL檢測陽性率顯著增加，線粒 體膜電位降低。結(jié)論：D-半乳糖可離體誘導(dǎo)細(xì)胞mtDNA4834b缺失突變,可模擬耳蝸血管紋 邊緣細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的“早老性”衰老 , 成功建立血管紋邊緣細(xì)胞和螺旋 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mtDNA4834b缺失突變擬老化細(xì)胞模型。目的：研究 SIRT1在 mtDNA4834b缺失突變形成中的作用,對細(xì)胞衰老(p-半乳糖苷酶和凋亡)和線粒 體功能(線粒體膜電位)的影響

6、,與線粒體相關(guān)因子核呼吸因子一1(NRF-1)、線粒 體轉(zhuǎn)錄因子 A (mitochondrial transcription factor A, mtTFA)、過氧化物酶 增值子激活受體-丫亞單位共激活因子1 a (peroxisomeproliferator-activated receptor y coactivator 1 a, PGC-1 a )、線粒體細(xì)胞色素 C 氧化酶亞單位川(cytochrome oxidase cytochrome oxidase sub unit III,COXIII) 和線粒體內(nèi)膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白解偶聯(lián)蛋白 2(uncoupling protein 2,

7、UCP-2)之間的關(guān)系，以及其對自由基清道夫超氧化物歧化酶的作用，探討SIRT1 影響mtDNA4834b缺失突變及細(xì)胞衰老的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)血管紋邊緣細(xì)胞 , 分為 sirtinol 抑制劑組 (SIR 組) 、白藜蘆 醇激動劑組(RSV組)、DMSO介質(zhì)對照組(DMS(組)及對照組(CONT組)。當(dāng)原代血 管紋邊緣細(xì)胞純化融合成單層后將細(xì)胞傳代分為以上四組 , 按以下方法繼續(xù)培養(yǎng) 168h: (1)SIR 組：60 卩 M sirtinol( 無菌 DMSO己制9)+12g/L D 半乳糖 + 完全培 養(yǎng)基(DMSO濃度為0.125 %。) ; (2)RSV組：20卩M白藜蘆醇(無菌D

8、MSO己 制)+12g/LD 半乳糖+完全培養(yǎng)基(DMSO濃度為0.125 %) ; (3)DMSO組： DMSO+12g/D半乳糖 +完全培養(yǎng)基(DMSO濃度為 0.125 %) ;(4)CONT組：12g/L D 半乳糖+完全培養(yǎng)基。應(yīng)用Taqman熒光探針實(shí)時定量PCRf目對定量方法檢測比較各組 mtDNA4834b缺失突變率；B 半乳糖苷酶染色法檢測各組細(xì)胞衰老狀態(tài)； Ann exin V -PI雙染以及JC-1熒光探針染色流式細(xì)胞儀分別檢測各組細(xì)胞凋亡及 線粒體膜電位變化情況； 實(shí)時定量 PCR(real-time quantitative PCR,RTqPCRs) 檢測mtDNA目

9、對拷貝數(shù)及各組細(xì)胞 SIRT1、NRF-1、mtTFA PGC-仏、COXIII和 UCP-2的：mRNAK平；蛋白免疫印記(western blot)檢測各組SIRT1、乙?；M 蛋白3(Ac-H3)、UCP-2蛋白水平；免疫沉淀+蛋白免疫印記檢測PGC-仏蛋白水 平及PGC-1a乙?；?Ac-PGC-la);WST-1法檢測各組 MnSOWu/ZnSOD舌性。結(jié)果：(1)SIRT1激動劑白藜蘆醇能有效降低D半乳糖糖誘導(dǎo)的mtDNA大片段缺矢能顯著性降低D-半乳糖誘導(dǎo)的血管紋邊緣細(xì)胞的“早老性”細(xì)胞表型：p半乳糖苷酶染色陽性率顯著性降低 ,細(xì)胞凋亡減少 ,線粒體膜電位補(bǔ)救性回升。SIRT

10、1抑制劑sirtino1 表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。(2)RSV組線粒體DNA相對拷貝數(shù) 增加,SIR組降低。(3)RSV組 SIRT1、NRF-1、mtTFA PGC-仏、COXH 的 mRN水平較 DMS(組及 CON組上調(diào),有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05); SIR組SIRT1 mRN水平相對DMSO!及CON組無明顯差異，NRF-1、mtTFA PGC-仏、COXtt mRN水平有統(tǒng)計學(xué)意義的降 低(P<0.05) ; DMSO!與CONTfi無統(tǒng)計學(xué)差異；各組UCP-2mRN水平無統(tǒng)計 學(xué)差異。(4)RSV組SIRT1、PGC-a蛋白水平相對 DMSO&及CONT&上調(diào),Ac-H3, Ac-PGC-1a及UCP-2蛋白水平下降,差異有顯著性(P<0.05); SIR組SIRT1蛋白表達(dá)與DMSOI及CONTS比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，相對于DMSOI及CONTA PGC-a蛋白水平下調(diào),Ac-H3,乙?；疨GC-1a 及 UCP-2蛋白水平上調(diào),差異有統(tǒng) 計學(xué)意義(P<0.05); DMSO&與CONT&之間蛋白表達(dá)量無明顯差