SaponinsPD的提取分離及藥物代謝動力學(xué)研究

1、Saponins PD 的提取分離及藥物代謝動力學(xué)研究Saponins PD, 為五壞三帖皂苷類化合物 , 存在于白頭翁 (Pulsatilla chinensis) 、洋常春藤 (Hedera helix) 、黑種草 (Nigella sativa) 、黃褐毛忍冬 (Lonicera fulvotomentosa) 等多種植物中 , 現(xiàn)代藥理研究表明 ,Saponins PD 具 有抗腫瘤、抗炎、保肝、抗利什曼原蟲等藥理活性。其抗腫瘤活性越來越多的受 到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。課題組前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Saponins PD 具有明顯抗腫瘤作用 ,但其口服生物利 用度極低(<1%)?；?/p>

2、目前有關(guān)Saponins PD的研究多集中在其含量測定、藥 理及生物活性研究等方面,本課題組以開發(fā)Saponins PD抗腫瘤新藥為目的,探索 其口服生物利用度低的原因,對Saponins PD的提取分離、吸收、藥代動力學(xué)、 體內(nèi)藥物代謝等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究 , 為進(jìn)一步開發(fā)研究 Saponins PD 提供科學(xué)依 據(jù)。本文主要研究內(nèi)容分如下幾部分：第一部分Saponins PD的提取分離及鑒定為了獲得穩(wěn)定可靠的提取分離工藝及質(zhì)量可靠的原料 , 本文對 Saponins PD 的提 取分離工藝進(jìn)行了研究 , 采用硅膠柱層析及重結(jié)晶的方法進(jìn)行 Saponins PD 的分 離制備,再運(yùn)用核磁波譜技

3、術(shù)和HPLC法進(jìn)行結(jié)構(gòu)的確證和含量測定，得到含量達(dá) 98%上的Saponins PD,為后續(xù)理化性質(zhì)、藥理活性、藥物體內(nèi)過程評價的研究 提供物質(zhì)保障。第二部分Saponins PD抗腫瘤活性研究為了對Saponins PD的抗 腫瘤活性進(jìn)行篩選,采用MTT法測定了 Saponins PD對10種腫瘤細(xì)胞的生長抑制 活性,結(jié)果表明,Saponins PD對10種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用,與文獻(xiàn)報道 一致。利用小鼠H22荷瘤、S180荷瘤、Lewis荷瘤實(shí)驗(yàn),初步分析了 Saponins PD 對小鼠的腫瘤抑制情況。結(jié)果表明,灌胃給藥高、中、低劑量Saponins PD對H22荷瘤的抑瘤率均達(dá)4

4、0%以上；高、中劑量對 S180荷瘤的抑瘤率達(dá)40%以上；高、 低劑量對 Lewis 荷瘤的抑瘤率達(dá) 40%以上,說明對三種荷瘤均具有一定的抑制作 用。腹腔注射高、中、低劑量Saponins PD對Lewis荷瘤有明顯的抑制作用抑瘤 率分別為 72.9%、 70.5%、 47.7%,與陽性藥物順鉑的抑瘤率相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)還考察了 能夠反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)的脾臟和胸腺臟器指數(shù)以及能反映機(jī)體骨髓造血功 能的血細(xì)胞計數(shù)指標(biāo)，結(jié)果表明：Saponins PD在抑制腫瘤的同時對機(jī)體免疫系. 統(tǒng)影響不大 , 不會造成類似環(huán)磷酰胺那么顯著的免疫抑制 , 對機(jī)體骨髓造血功能 無明顯抑制作用。第三部分Saponins

5、 PD理化性質(zhì)研究Saponins PD的主要理化性質(zhì)是影響其 藥效及制劑設(shè)計的關(guān)鍵因素,本文采用HPLC法對Saponins PD在常溫下的長期穩(wěn) 定性、平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)進(jìn)行了測定。 采用搖瓶法進(jìn)行平衡溶解度 及表觀油水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn),用高效液相色譜法測定SaponinsPD在水、有機(jī)溶劑和 緩沖液中的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示：常溫常壓下放置，Saponins PD在16個月內(nèi)穩(wěn)定；在水中的平衡 溶解度為0.01mg mL-1,在有機(jī)溶劑正丁醇中的溶解性最好,為86.10mg mL-1; 在正辛醇 -水中的表觀油水分配系數(shù)為 24.73(logP=1.39),SaponinsPD 的油水

6、分 配系數(shù)在適宜的范圍內(nèi)，但是其水溶性很差,可能會影響Saponins PD的吸收。第 四部分Saponins PD及Saponins PD鈉鹽的在體腸吸收研究大鼠在體腸單向灌流 模型是目前研究藥物吸收機(jī)制應(yīng)用最多 , 國際上公認(rèn)的、經(jīng)典的、成熟的模型和 工具。為進(jìn)一步探討 SaponinsPD 的溶解性對吸收的影響 , 本節(jié)實(shí)驗(yàn)對 Saponins PD 及其鈉鹽的腸吸收機(jī)制進(jìn)行研究。采用大鼠在體腸單向灌流模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn) , 利用 HPLC法對藥物的質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測,考察不同腸段、藥物不同質(zhì)量濃度、藥液不 同pH腸道菌群以及P-gp抑制劑對藥物吸收的影響。結(jié)果表明，Saponins PD在不同

7、腸段的吸收速率常數(shù) Ka大小順序?yàn)榛啬c> 結(jié)腸>空腸>十二指腸；Saponins PD在堿性環(huán)境下吸收較好：在腸道的吸 收機(jī)制可能為被動擴(kuò)散；腸道菌群對 Saponins PD吸收有顯著性影響；Sapo nins PD不是P-gp底物。對Saponins PD鈉鹽在不同腸段和不同質(zhì)量濃度下進(jìn)行在體 腸吸收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,Saponins PD鈉鹽在不同腸段均有吸收，其吸收速率常數(shù) K。大小順序是空腸>十二指腸>回腸>結(jié)腸。Saponins PD鈉鹽不同濃 度下在大鼠空腸的吸收參數(shù)沒有顯著性差異 , 提示 Sap

8、onins PD 鈉鹽在小腸的吸 收沒有濃度依賴性 , 吸收機(jī)制可能為被動擴(kuò)散。上述研究揭示,Saponins PD腸道吸收較差，制成鈉鹽后，吸收有所增加，主要 吸收部位發(fā)生改變 , 說明藥物的溶解性對吸收有影響。 同時, 通過實(shí)驗(yàn)推測化合物 本身的水溶性差及腸道菌群的代謝可能是導(dǎo)致其吸收差的重要原因。第五部分Saponins PD、Saponins PD鈉鹽、Saponins PD環(huán)糊精包合物大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究藥物動力學(xué)研究對于藥物生物利用度、 療效、毒性的評價 及由此延伸出的藥物劑型設(shè)計等方面具有十分重要的作用。為了深入了解 Saponins PD 在大鼠體內(nèi)吸收情況以及 Saponi

9、ns PD 的藥理活性機(jī)制 , 本文對大 鼠灌胃和靜脈給藥Saponins PD、灌胃給藥SaponinsPD鈉鹽和Saponins PD環(huán)糊精包合物后在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)進(jìn)行全面的考察和研究。首先建立了生物樣品中檢測 Saponins PD的HPLC-MS/M方法,檢測了大鼠血漿中的藥物濃度 ,并進(jìn)行了藥代動力學(xué)參數(shù)的計算。結(jié)果表明 ,Saponins PD、Saponins PD環(huán)糊精包合物、Saponins PD鈉鹽在大鼠體內(nèi)的吸收非常慢,吸收總 量小, 口服生物利用度極低 ,Saponins PD 制成鈉鹽后口服生物利用度有所提高 , 說明增加其在水中的溶解度 , 有利于吸收。第六部

10、分Saponins PD、Saponins PD鈉鹽、Saponins PD環(huán)糊精包合物大 鼠體內(nèi)組織分布研究基于前述體內(nèi)吸收實(shí)驗(yàn)推測 ,Saponins PD 可能與某些組織 有特殊結(jié)合,為了探索藥物進(jìn)入生物體內(nèi)在各組織中的分布情況 ,以及不同的制 劑是否會影響體內(nèi)藥物的分布。本文采用HPLC-MS/M法分別對灌胃Saponins PD Saponins PD鈉鹽、Saponins PD環(huán)糊精包合物后,大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、 肌肉、脂肪中藥物的濃度進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示, 在檢測的 8個組織中均有分布 ,SaponinsPD、 Saponins PD 鈉鹽、 Saponins PD 環(huán)糊精

11、包合物的分布趨勢基本一致 , 對肝、肺有一定的靶向性。第 七部分Saponins PD大鼠體內(nèi)排泄研究在藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)Saponins PD的生物利用度極低,為了尋找生物利用度低的原因,本文采用HPLC-MS/M法測 定大鼠灌胃給予Saponins PD后,不同時間段尿液和糞便中Saponins PD的濃度。結(jié)果表明,大鼠灌胃給予Saponins PD后,72h內(nèi)在尿和糞中的累積總排泄率達(dá)77.03%,說明主要以原型藥物排泄。第八部分 Saponins PD在大鼠體內(nèi)的代謝 研究 Saponins PD 藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明 , 其口服生物利用度極低 (<1%) 。

12、但前期抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)中 , 其口服仍能表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性 , 推測可能 某些代謝物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性； 另對Saponins PD灌胃后大鼠糞便和尿液的排泄研究發(fā)現(xiàn),其在尿和糞中的總排泄率為 77.03%,主要以原型排泄 ,但有22.97% 的 Saponins PD 則去向不明 , 可能以代謝物的形式排泄。本文采用UHPLC-TripleTOF-MS/MS寸大鼠在體腸孵育樣品及灌胃給藥后膽汁、尿液、糞便 和血液樣品進(jìn)行了分析 ,推測了 Saponins PD 在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。經(jīng)分析得到各代謝物的二級質(zhì)譜圖 , 通過與原型藥物的二級質(zhì)譜圖及質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行比較,結(jié)合Peak View軟件進(jìn)行分子式的擬合,共推測鑒定了除原型藥 物及其同分異構(gòu)體外的 26個代謝產(chǎn)物,其中包括了一些代謝物的同分異構(gòu)體。 從 代謝物的結(jié)構(gòu)來看 , 原型藥物在體內(nèi)主要發(fā)生了氧