GSK-3β調(diào)控小鼠卵母細胞第一次減數(shù)分裂與原始卵泡形成機制的研究

1、GSK-3B調(diào)控小鼠卵母細胞第一次減數(shù)分裂與原始卵泡形成機制的研究成年雌性哺乳動物的卵巢中不存在生殖干細胞資源 , 因而出生前后卵巢中形 成的原始卵泡庫容量就成為其終生可利用的生育力資源。在胚胎期卵巢中 , 卵母 細胞經(jīng)歷第一次減數(shù)分裂前期后阻滯于核網(wǎng)期 , 隨后少部分的單個未成熟的卵母 細胞被周圍的扁平顆粒細胞包裹 ,形成原始卵泡 , 而大多數(shù)卵母細胞死亡丟失。 胚 胎期卵母細胞減數(shù)分裂異常將直接導(dǎo)致原始卵泡庫建立障礙。因此, 探究胚胎卵母細胞內(nèi)精確的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于更好地理解雌性生殖儲 備的建立具有重要意義。糖原合成激酶 3 B (GSK-3B )是一種高度保守的絲、蘇 氨酸激酶,在細胞內(nèi)

2、發(fā)揮多種催化作用。已知GSK-3B通過磷酸化不同的底物,參 與調(diào)控細胞內(nèi)的蛋白合成、 細胞增殖與分化、微管動力以及細胞凋亡等生理過程。然而, 關(guān)于 GSK-3B 在早期卵母細胞發(fā)生以及原始卵泡庫建立過程中的功能 研究仍然空缺。針對這一科學(xué)問題 , 我們展開了以下研究工作。免疫熒光檢測結(jié) 果證明 ,GSK-3B 在小鼠胚胎期與新生前后卵巢中表達廣泛 , 分布于體細胞與卵母 細胞的胞質(zhì),而卵母細胞內(nèi)GSK-3B的活性隨胚胎卵巢發(fā)育進程呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。在功能探究實驗中,通過體外培養(yǎng)添加GSK-3B特異性抑制劑BIO后發(fā)現(xiàn),抑 制 GSK-3B 活性的胚胎卵巢中處于第一次減數(shù)分裂前期的卵母細胞發(fā)生大量凋

3、 亡, 導(dǎo)致卵巢卵母細胞數(shù)量顯著少于對照組卵巢。對卵母細胞減數(shù)分裂進程的研 究發(fā)現(xiàn),抑制GSK-3B后,胚胎卵母細胞減數(shù)分裂進程受阻,部分卵母細胞無法進 入雙線期；同時DSBs修復(fù)異常的卵母細胞比例顯著增加。通過對DNA損傷檢驗點 蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK-3B活性后，在胚胎卵巢中負責卵母細胞質(zhì)量監(jiān)管及 執(zhí)行凋亡的B 63異常地在卵母細胞中提前表達，同時下游凋亡執(zhí)行相關(guān)基因的 表達也發(fā)生顯著上調(diào)進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)：胚胎期卵母細胞內(nèi)GSK-3B通過磷酸化B -catenin 介導(dǎo)了 B 63的轉(zhuǎn)錄;GSK-3 B受抑制后,B -catenin降解受阻,在胞質(zhì)積累后發(fā) 生入核，激活B 63的轉(zhuǎn)

4、錄，造成胚胎卵母細胞凋亡。當我們同時拮抗B -catenin的轉(zhuǎn)錄活性時 , 卵母細胞凋亡的現(xiàn)象能夠得到拯救。另外 , 在體實驗證明 , 在小鼠 胚胎期與新生前后的卵母細胞中 , B -catenin 的轉(zhuǎn)錄活性與 B 63 的表達上調(diào)趨 勢一致,揭示在卵母細胞第一次減數(shù)分裂前期,GSK-3 B通過磷酸化降解B -catenin, 從而維持卵母細胞的存活 ; 而出生前后原始卵泡大量形成階段 ,GSK-3 B活性下調(diào),B -catenin的轉(zhuǎn)錄活性上升,激活B 63轉(zhuǎn)錄,監(jiān)管卵母細胞質(zhì)量并 清除有遺傳缺陷的卵母細胞。為了證明上述體外研究發(fā)現(xiàn)的 GSK-3B調(diào)控卵母細胞存活的作用,本研究進 一步采

5、用體內(nèi)基因敲除小鼠模型驗證了GSK-3 B在早期卵母細胞發(fā)生過程中的必要性。通過構(gòu)建 Cre-LoxP 條件性敲除小鼠模型 , 我們得到在生殖細胞中特異性 敲除Gsk-3 B的小鼠(conditional KO;cKO)。表型分析顯示,新生1天時,cKO小 鼠卵巢卵母細胞數(shù)量明顯少于野生型小鼠,與體外使用GSK-3B抑制劑培養(yǎng)胚胎 期卵巢的結(jié)果一致；至新生7天時,cKO小鼠卵巢生長卵泡數(shù)量與野生型小鼠無顯 著差異 , 但原始卵泡數(shù)量顯著少于野生型小鼠。同時我們證明,cKO小鼠卵巢卵母細胞發(fā)生顯著的凋亡。另外,在新生1天cKO 小鼠卵巢中，DSBs標記蛋白與修復(fù)蛋白持續(xù)表達，表明敲除小鼠卵母細胞DSBS修 復(fù)發(fā)生了障礙。綜上，本研究證明在小鼠胚胎期卵巢內(nèi),GSK-3B對于第一次減數(shù) 分裂前期的卵母細胞的存活具有重要作用。GSK-3B通過調(diào)控B -catenin的