納米銀殺菌機(jī)理研究

1、.納米銀抑菌機(jī)理研究方案納米銀對細(xì)菌有抑制作用，但具體機(jī)理并不清楚。目前已有很多學(xué)者根據(jù)納米銀對細(xì)菌抑制作用的宏觀現(xiàn)象，提出納米銀對細(xì)菌抑制機(jī)理的推測，如納米銀可能影響微生物細(xì)胞的呼吸系統(tǒng)，損傷DNA，破壞細(xì)胞膜等。但對細(xì)胞壁等方面研究很少。我們將設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)闡明納米銀對細(xì)菌有抑制作用的具體機(jī)理。研究的主要內(nèi)容包括納米銀對細(xì)胞壁的破壞的機(jī)理，對細(xì)胞膜的損害，對細(xì)胞呼吸鏈酶的影響，對DNA損傷等方面，從而明確納米銀對細(xì)菌的抑制作用的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)步驟1抑菌試驗(yàn)方法1.1抑菌率實(shí)驗(yàn)用系列稀釋法制得膠體銀溶液濃度為10 ppm、20 ppm、40 ppm、80 ppm、100 ppm 的PBS 緩沖液，加入

2、0.2 mL 菌懸液(大腸菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉，最終培養(yǎng)基中菌液濃度為1×106 cfu/mL)，作用20min然后取1 mL 混合液投入到9 mL 的PBS 緩沖液中，做系列稀釋，取其中3 個稀釋度，吸取0.5 mL 置于平皿中迅速用涼至4045 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL 作傾注，轉(zhuǎn)動平皿，使得稀釋液與培養(yǎng)基充分混勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，37 培養(yǎng)24 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。抑菌率計(jì)算方法公式：X=(A-B)/A×100其中：X抑菌率，A對照樣品中的平均菌落數(shù)，B被試樣品的平均菌落數(shù)1.2抑菌圈實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺內(nèi)，將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，制成平板

3、，用可調(diào)式移液器移取 1mL 濃度為 10+8cfu/L 的大腸桿菌于無菌的瓊脂平板上， 5min 后，每個牛津杯中加入 20L 納米銀溶膠，置于 37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h。在菌體生長的同時，樣品試液均勻擴(kuò)散到瓊脂平板上，抑制其周圍的微生物生長，從而產(chǎn)生不長菌的透明抑菌圈。按互成 60°的 3 個直徑方向測量透明抑菌圈直徑，計(jì)算平均值，從而測量出大腸桿菌納米銀作用下的抑菌圈大小。在相應(yīng)培養(yǎng)基上以相同的方法測量其它六種菌株的抑菌圈的大小。與細(xì)菌不同的是應(yīng)該將10+7cfu/L 酵母菌涂布在 YEPD 固體培養(yǎng)基上，放置在 28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h。2. 1納米銀對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁

4、影響2.1.1采用透射電鏡觀察了經(jīng)納米銀粒子處理過的大腸桿菌細(xì)胞的形態(tài)變化過程,觀察細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變化2.1.2通過革蘭氏染色判斷細(xì)菌經(jīng)納米銀處理前后，細(xì)胞壁是否發(fā)生變化2.1.3測定納米銀處理前后MDA含量的變化，丙二醛（MDA）是常用的膜質(zhì)過氧化指標(biāo)，判斷膜質(zhì)過氧化情況。2.1.4測定乳酸脫氫酶(LDH) 濃度，乳酸脫氫酶(LDH)是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化時的一種轉(zhuǎn)化酶，正常情況下，胞外含有少量，但在細(xì)胞受損的情況下，就會由細(xì)胞漏出至胞外。判斷納米銀是否引起細(xì)胞膜破裂。菌懸液加入10mmol/了的葡萄糖和納米銀溫育，間隔10min取樣，用0.22um孔

5、徑的無菌硝酸纖維素膜過濾，濾液測胞外乳酸脫氫酶含量和紫外吸收物質(zhì)。紫外吸收物質(zhì)在260nm下測定光吸收值。2. 2 納米銀對DNA的影響2.2.1用納米銀處理大腸桿菌DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察前后變化。（通過電鏡觀到經(jīng)納米銀粒子處理過的大腸桿菌細(xì)胞,DNA 不再隨機(jī)分布在細(xì)胞的核區(qū),而是在核區(qū)濃縮緊張態(tài)的現(xiàn)象）2.2.3觀察納米銀處理后細(xì)菌核區(qū)的變化(納米銀使大腸桿菌DNA 不再隨機(jī)分布在細(xì)胞的核區(qū)，而是在核區(qū)濃縮呈緊張態(tài)，并增加菌體內(nèi)總DNA 的降解程度)2. 3 納米銀對蛋白質(zhì)的影響2.3.1通過蛋白凝膠電泳觀察對蛋白質(zhì)的影響。2.3.2（納米銀顆粒在水或體液中可以釋放A擴(kuò)，而A擴(kuò)與含

6、琉基(一sH)的大分子有很強(qiáng)的結(jié)合力，可使微生物失活）將較高濃度牛血清白蛋白加入到納米銀膠體中，紫外一可見吸收光譜譜鋒明顯紅移，且吸光度值隨BSA濃度增加而下降，表明納米銀顆粒與蛋白質(zhì)發(fā)生直接的相互作用2.4納米銀對呼吸鏈酶的影響蘋果酸脫氫酶粗酶液的制備 將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期，按2%接種量加入到SI 終濃度為0.8 mg·ml-1 的50 ml 肉湯培養(yǎng)基中，以不加SI 組為對照，37，120 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)。待培養(yǎng)到8、12、16、20、24、28、32、36、40 h 后，分別將菌懸液于6 000 r/min 離心10 min，棄上清，雙蒸水洗滌3次，再用雙蒸

7、水將其分別配制成OD580 為0.6 的菌懸液。然后取該菌懸液各10 ml，6 000 r/min 離心10 min，棄上清，用緩沖液（0.1 mol·L-1 Tris-Hcl，20 mmol·L-1KCl，5 mol·L-1 MnSO4，2 mmol·L-1 DTT，0.1 mmol·L-1EDTA，pH7.0）洗滌2 次后，懸浮于10 ml 緩沖液中。用超聲波破碎儀（破碎強(qiáng)度為80%）將菌體破碎，每次10 S，間隔30 S，循環(huán)10 次，共計(jì)7 min，12 000 r/min離心15 min，除去細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液，于20冰箱中保

8、存，用于酶活力的測定。上述試驗(yàn)均在冰浴中進(jìn)行。蘋果酸脫氫酶比活性的測定 將2.5 ml 0.1mol·L-1 Tris-HCl（pH 8.8），0.1 ml 0.1 mmol·L-1 sodiummalate（蘋果酸鈉），0.1 ml 10 mmol·L-1 NAD+17的混合物順次加入石英比色皿中，然后快速加入0.3 ml 粗酶液引發(fā)反應(yīng)。每隔0.5 min，在340 nm 用可見光紫外分光光度計(jì)連續(xù)測定3 min，以A340nm 為縱坐標(biāo),時間t（min）為橫坐標(biāo)作圖，取反應(yīng)過程中的線性部分，計(jì)算A340nm/min 的增加值。以每分鐘A 值增加0.01為1 個酶活力單位。以小牛血清蛋白為對照，測定粗酶