zhou目的蛋白質(zhì)表達純化檢測

1、1會計學(xué)zhou目的蛋白質(zhì)表達純化檢測目的蛋白質(zhì)表達純化檢測實驗原理實驗原理實驗原理圖圖 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋白融合蛋白在在Hela細胞中的熒光顯微鏡檢測（細胞中的熒光顯微鏡檢測（400）例例 酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng) 昆蟲表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 表達的蛋白具有正常的表達的蛋白具有正常的活性、構(gòu)象活性、構(gòu)象 技術(shù)難度較大、耗時、技術(shù)難度較大、耗時、耗資耗資 大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng) 實驗技術(shù)簡單，時間實驗技術(shù)簡單，時間較短，費用低，系統(tǒng)較短，費用低，系統(tǒng)比較完備比較完備 不能有效地對重組蛋

2、不能有效地對重組蛋白質(zhì)進行修飾加工，白質(zhì)進行修飾加工，易形成包涵體易形成包涵體原核細胞表達系統(tǒng)原核細胞表達系統(tǒng) 真核細胞表達系統(tǒng)真核細胞表達系統(tǒng)實驗原理實驗原理PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位點多克隆位點實驗原理實驗原理實驗原理啟動子、終止子、核糖體識別序列操縱子序列及配套的調(diào)控基因 誘導(dǎo)性表達所需要的元件多克隆位點復(fù)制起始序列實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理AmpRPlasmidpGEX-KGGSTlacIqPtac PromoterAmprIPTG多克隆位點多克隆位點實驗原理BamH INde IBamH IcDNA酶切酶切Nde I基因片段基因片段酶

3、切后的目的基因酶切后的目的基因 酶切酶切 連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化篩選（藍白斑）篩選（藍白斑）鑒定（鑒定（PCR、酶切、測序、酶切、測序）原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建成功原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建成功實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理蛋白質(zhì)中加入蛋白質(zhì)中加入 SDS 并加熱，并加熱， SDS 分子上的非極性區(qū)分子上的非極性區(qū) (黃色尾巴黃色尾巴)會與蛋白質(zhì)上的非會與蛋白質(zhì)上的非極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿極性區(qū)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，成為一線狀長條分子，上面布滿 SDS 分子。分子。SDS 分分子的極性區(qū)子的極性區(qū) (洋紅色圓點洋紅色圓點)，則露在外面，以增加親水性。，則露在外面，以增加親水性。SD

4、S是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分是一種陰離子表面活性劑，能打斷氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。蛋白質(zhì)分子間的天然的電荷差異。SDS最終使蛋白質(zhì)變成具有高負電荷的線狀分子最終使蛋白質(zhì)變成具有高負電荷的線狀分子。97.0 kDa儀器與設(shè)備實驗試劑實驗步驟目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達及檢測SDS-PAGE12分離膠5%濃縮膠H2O2.45 ml 2.05ml30%丙稀酰胺3.0 ml0.5mlTris 緩沖液1.9 ml（1.5M pH8.8）375ul （1.0M pH6.8）10%SDS75 ul30ul10%過硫酸銨75 ul30ul TEMED3 ul3ul注：1 . 丙稀酰胺為神經(jīng)毒劑，使用時要小心，操作請務(wù)必戴手套。 2. 過硫酸銨需新鮮配制，并注意濃度，否則影響膠凝固。 3. 1塊膠可以用10 ml離心管，2塊膠要使用小三角瓶便于混勻，配制 后余液可暫時留存，便于參考膠凝固時間，一般30min即可。目的蛋白質(zhì)的檢測-考馬斯亮藍染色凝膠染色End實