23核酸分析技術(shù)OK

1、核酸分析技術(shù)電泳技術(shù)電泳技術(shù) 負極正極電泳現(xiàn)象 帶電粒子在電場中的定向移動電泳技術(shù) 利用電泳現(xiàn)象進行分離分析的技術(shù)n樣品的電荷效應(yīng) 帶電多，遷移快瓊脂糖凝膠電泳n凝膠的篩選效應(yīng) 分子量小，阻力小，遷移快n主要用于分離鑒定核酸 瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和鑒定核酸的方法純化和鑒定核酸的方法 瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物 根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊根據(jù)瓊?cè)芙鉁囟?，把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖脂糖 低熔點瓊脂糖熔點為低熔點瓊脂糖熔點為6265，溶解后在，

2、溶解后在37下維持液下維持液體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于體狀態(tài)約數(shù)小時，主要用于dna片段的回收，質(zhì)粒與外片段的回收，質(zhì)粒與外源性源性dna的快速連接等的快速連接等+_power瓊脂糖凝膠電泳分離dna凝膠制備上樣電泳染色結(jié)果觀察瓊脂糖凝膠電泳分離dna1. 凝膠制備濃 度（%）標 準(kb)高強度(kb)低熔點(kb)低黏度低溶點(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1 瓊脂糖類型瓊脂

3、糖類型凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度/熔化溫度熔化溫度/ 標準瓊脂糖標準瓊脂糖35389095不同廠家不同廠家生產(chǎn)的不生產(chǎn)的不同商品其同商品其凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度和熔化溫和熔化溫度有一定度有一定差異差異40428590 高強度瓊脂糖高強度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點修飾的低熔點/ 凝凝點瓊脂糖點瓊脂糖253563653565 超低熔點超低熔點8154045 低黏性低熔點瓊脂低黏性低熔點瓊脂糖糖25307038853075不同類型瓊脂糖的性質(zhì)不同類型瓊脂糖的性質(zhì)電泳緩沖液電泳緩沖液 常用三種緩沖液常用三種緩沖液 tris-硼酸硼酸(tbe)、tris-乙酸乙酸(tae)、tris-磷酸磷酸(tpe) tb

4、e與與tpe：緩沖容量高，緩沖容量高，dna分離效果好，但分離效果好，但tpe在在dna片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使片段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使dna沉淀沉淀 tae：緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用tae。緩沖液中的緩沖液中的 edta 可螯合二價陽離子，從而抑制可螯合二價陽離子，從而抑制dna酶酶的活性，防止的活性，防止pcr擴增產(chǎn)物降解擴增產(chǎn)物降解瓊脂糖凝膠電泳分離dna加熱后加熱前1. 凝膠制備瓊脂糖凝膠電泳分離dna2. 上樣三個作用：1）增加樣品密度保證dna沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中

5、以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。核酸電泳的上樣緩沖溶液核酸電泳的上樣緩沖溶液6凝膠載樣緩沖液凝膠載樣緩沖液類型類型6 緩沖液緩沖液貯存溫度貯存溫度i0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%二甲苯氰二甲苯氰ff40% (m/v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液ii0.25%溴酚藍溴酚藍室溫室溫0.25%二甲苯氰二甲苯氰ff15% ficoll(type400)水溶液水溶液iii0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%溴酚藍溴酚藍%二甲苯氰二甲苯氰ff30%甘油水溶液甘油水溶液iv0.25440% (m/v)蔗糖水溶液蔗糖水溶液核酸電泳的指示劑核酸電泳的指示劑 指示劑：溴酚蘭、二甲苯青指示劑：溴酚蘭、二甲苯青 溴酚蘭溴酚

6、蘭：在堿性液體中呈紫蘭色，電泳中，溴酚蘭的遷移在堿性液體中呈紫蘭色，電泳中，溴酚蘭的遷移率與雙鏈線性率與雙鏈線性dna片段片段 二甲苯青：二甲苯青：水溶液呈蘭色，電泳時，其遷移速率與雙鏈線水溶液呈蘭色，電泳時，其遷移速率與雙鏈線性性dna大致相當(dāng)大致相當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度0.6%1%1.4%2%遷移率遷移率1kb0.6kb0.2kb0.15kb瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖凝膠濃度1%1.4%遷移率遷移率2kb1.6kb瓊脂糖凝膠電泳分離dna3. 電泳瓊脂糖凝膠電泳分離dna4. dna染色溴化乙錠核酸電泳的染色劑核酸電泳的染色劑溴化乙錠溴化乙錠一種熒光染料，一種熒光染料，eb分子可嵌入核分

7、子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光可在凝膠電泳液中加入終濃度為可在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的的eb，有時亦可在電泳有時亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色染色1015min瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠eb染色，肉眼可見核染色，肉眼可見核酸電泳帶，其酸電泳帶，其dna量一般量一般5ng溴化乙錠太多，凝膠染色過深，溴化乙錠太多，凝膠染色過深，核酸電泳帶看不清時，可將凝膠核酸電泳帶看不清時，可將凝膠放入蒸餾水浸泡放入蒸餾水浸泡30min后再觀察后再觀察ethidium bromide，e

8、bn+h2nnh2c2h5br-瓊脂糖凝膠電泳分離dna5. 結(jié)果觀察dna的遷移速率決定因素 1 dna1 dna分子的大小分子的大小 雙鏈dna分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比； 2 2 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快； 3 dna3 dna的構(gòu)象的構(gòu)象 超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀。 4 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（eb）插入雙鏈dna造成其負電荷減少、剛性和長度增加。 5 5 所用的電壓所用的電壓 低電壓時dna片段遷移率與所用的電壓成正比。 6 6 瓊脂糖種類瓊脂糖種類 常見的有兩種：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；

9、n樣品的電荷效應(yīng)和凝膠的篩選效應(yīng)是分離的主要依據(jù)n凝膠是由丙烯酰胺聚合而成聚丙烯酰胺凝膠電泳（page） 在temed (四甲基乙二胺) 催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈。 在雙功能交聯(lián)劑如n，n-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。 網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì) 優(yōu)點 聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對ph和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。（二）（二） 聚丙烯酰胺

10、凝膠電泳種類聚丙烯酰胺凝膠電泳種類 1 變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈dna片段的分離或純化。 變性的dna在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。 用途：放射性dna探針的分離、dna測序反應(yīng)等。 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈dna片段的分離和純化。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：制備高純度的dna片段。 染色染色考馬斯亮藍染色 考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)

11、中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。銀染色銀染色 銀染色液中的銀離子(ag )可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然后用還原劑如甲醛 使ag 還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。 也用于瓊脂糖凝膠染色。其靈敏度比eb高200倍。但銀染色后，dna不宜回收。 dnadna在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）二甲苯氰二甲苯氰ff溴酚藍溴酚藍3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:n,n-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30; page電泳裝置page的結(jié)果觀察考馬斯藍染色凝膠成像儀掃描末端終止法sanger2，3雙脫氧核苷三磷酸（ddntp）是dna合成鏈延伸的抑制劑。核苷酸序列測定dna序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團標記的dntp（二）dna的化學(xué)法測序： 由maxam和gilbert所發(fā)明。 其基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于dna分