實驗硫酸銨分級沉淀分離苯丙氨酸解氨酶實用教案

1、一、實驗一、實驗(shyn)背景背景 了解硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的原理；掌握了解硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的原理；掌握(zhngw)分級沉淀分離酶的基本操作分級沉淀分離酶的基本操作和方法和方法第1頁/共16頁第一頁，共16頁。二、實驗二、實驗(shyn)原理原理 鹽析：鹽析： 在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋白質(zhì)沉淀析出稱為鹽析，因為中性白質(zhì)沉淀析出稱為鹽析，因為中性鹽在水中解離時，能奪走蛋白質(zhì)膠鹽在水中解離時，能奪走蛋白質(zhì)膠粒表面的水分子，破壞水膜結(jié)構(gòu)；粒表面的水分子，破壞水膜結(jié)構(gòu)；同時中性鹽解離后形成的帶電離子同時中性鹽解

2、離后形成的帶電離子能中和蛋白質(zhì)表面的電荷能中和蛋白質(zhì)表面的電荷(dinh)，這兩種作用使溶液中蛋白質(zhì)沉淀析這兩種作用使溶液中蛋白質(zhì)沉淀析出。出。第2頁/共16頁第二頁，共16頁。 分級沉淀：分級沉淀： 不同鹽濃度下各種蛋白質(zhì)的溶解度是不不同鹽濃度下各種蛋白質(zhì)的溶解度是不同的，因此調(diào)節(jié)溶液的鹽濃度可使各種同的，因此調(diào)節(jié)溶液的鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)先后沉淀出來，或者使需要的酶蛋白質(zhì)先后沉淀出來，或者使需要的酶與其它雜質(zhì)蛋白分開，達到提純目的，與其它雜質(zhì)蛋白分開，達到提純目的，這就是分級沉淀法。這就是分級沉淀法。 硫酸銨沉淀一般在蛋白純化硫酸銨沉淀一般在蛋白純化(chn hu)的步驟中前期用，它簡便且

3、重復性好，的步驟中前期用，它簡便且重復性好，但純化但純化(chn hu)倍數(shù)不高。分級沉淀倍數(shù)不高。分級沉淀中需加的固體硫酸銨或飽和硫酸銨溶液中需加的固體硫酸銨或飽和硫酸銨溶液的量，可從硫酸銨飽和度量表中查得。的量，可從硫酸銨飽和度量表中查得。第3頁/共16頁第三頁，共16頁。第4頁/共16頁第四頁，共16頁。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine:ammonia lyase，簡稱PAL）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物的正常生長發(fā)育和抵御病菌侵害的過程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨

4、，產(chǎn)物反式肉桂酸在波長290nm處有最大吸收值。在反應系統(tǒng)中如果酶的加入量適當，反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在幾小時內(nèi)保持不變，因此，可通過測定A290 升高的速率來測定PAL的活力。規(guī)定1小時內(nèi)A290增加0.01為PAL的一個(y )活力單位。第5頁/共16頁第五頁，共16頁。三、實驗三、實驗(shyn)試劑試劑 0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（PH8.7） 酶提取液0.1mol/L硼酸-硼砂緩沖液（內(nèi)含1mmol/L EDTA、20mmol/L-巰基乙醇）。取100ml 0.1mol/L 硼酸-硼砂緩沖液（PH8.7）,加入0.037克EDTA鈉鹽，混勻，臨用前再加入0.

5、137ml-巰基乙醇，混勻； 0.6mmol/L L-Phe溶液。 稱取L-Phe 9.912毫克(ho k)溶于100ml蒸餾水中； 6N HCl溶液 固體（NH4）2SO4第6頁/共16頁第六頁，共16頁。四、實驗四、實驗(shyn)步驟步驟 1、 酶液提?。好敢禾崛。?（1）取小麥幼苗（發(fā)芽）取小麥幼苗（發(fā)芽56天）天）2克，用剪刀剪成小段后，立即放入有克，用剪刀剪成小段后，立即放入有10 ml酶提取液的研缽酶提取液的研缽(yn b)中，于中，于冰浴上研磨勻漿，勻漿結(jié)束前，再加冰浴上研磨勻漿，勻漿結(jié)束前，再加入入10ml酶提取液研磨混勻酶提取液研磨混勻 （2）將已勻漿的酶液，用三層紗布）

6、將已勻漿的酶液，用三層紗布過濾、擠干。濾液轉(zhuǎn)入離心管，平衡過濾、擠干。濾液轉(zhuǎn)入離心管，平衡后，于后，于10,000 g下冷凍離心下冷凍離心30min； （3）取離心后的上清液（酶粗提）取離心后的上清液（酶粗提液），量出其體積液），量出其體積V1，放置冰浴中備，放置冰浴中備用。用。第7頁/共16頁第七頁，共16頁。實驗實驗(shyn)步驟步驟 2. 硫酸銨分級沉淀酶蛋白：硫酸銨分級沉淀酶蛋白： （1）從酶粗提液中吸取出）從酶粗提液中吸取出0.5 ml，以作后面活力測定等用，根據(jù)實際以作后面活力測定等用，根據(jù)實際體積體積(tj)和硫酸銨飽和度用量表，和硫酸銨飽和度用量表，算出達到算出達到40%飽和

7、度實際應加入酶飽和度實際應加入酶液中的硫酸銨量，并稱取該量的硫液中的硫酸銨量，并稱取該量的硫酸銨；酸銨； 第8頁/共16頁第八頁，共16頁。第9頁/共16頁第九頁，共16頁。（2）將酶液到入燒杯內(nèi)，燒杯置于冰浴中，然后在邊緩慢攪拌下緩慢加入稱好的固體硫酸銨（不能有大顆粒(kl)，放在研缽中研碎），待全部硫酸銨加入后，再緩慢攪拌20min；第10頁/共16頁第十頁，共16頁。實驗實驗(shyn)步驟步驟 2. 硫酸銨分級沉淀酶蛋白：硫酸銨分級沉淀酶蛋白： （3）將上述溶液到入離心管，）將上述溶液到入離心管，3,000g下冷凍離心下冷凍離心30min，倒上清液于燒杯內(nèi)，倒上清液于燒杯內(nèi)，保留沉淀，

8、記為沉淀保留沉淀，記為沉淀1； （4）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表中，查）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表中，查出從出從40%到到75%飽和度所需硫酸銨用量，飽和度所需硫酸銨用量，算出并稱取實際算出并稱取實際(shj)應加的硫酸銨量；應加的硫酸銨量； （5）按上述（）按上述（2）、（）、（3）步同法處理，）步同法處理，離心后，倒出上清液，保留沉淀，記為離心后，倒出上清液，保留沉淀，記為沉淀沉淀2。第11頁/共16頁第十一頁，共16頁。實驗實驗(shyn)步驟步驟 3.酶活力測定：酶活力測定： （1）將沉淀）將沉淀1和沉淀和沉淀2分別溶于分別溶于1ml酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，

9、量出其體積量出其體積V2、V3，記為沉淀液，記為沉淀液1和和2； （2）分別從沉淀液）分別從沉淀液1和和2中吸出中吸出0.2ml加入加入(jir)另外二個試管內(nèi)，另外二個試管內(nèi)，然后用酶提取液分別將其稀釋成然后用酶提取液分別將其稀釋成1ml，記為稀釋沉淀液記為稀釋沉淀液1和和2； （3）取試管）取試管7支，按下列編號并加支，按下列編號并加入入(jir)各試劑：各試劑： 管試 號 劑 0112233PH8.7 0.1mol/L 硼酸緩沖液（ml）4.03.94.93.94.93.94.9酶粗提取液(ml)/0.10.1/稀釋沉淀液1(ml)/0.10.1/稀釋沉淀液2（ml）/0.10.10.6

10、mmol/L L-Phe(ml)1.01.0/1.0/1.0/第12頁/共16頁第十二頁，共16頁。實驗實驗(shyn)步驟步驟 3.酶活力測定：酶活力測定： （4）以上試管放入恒溫水?。┮陨显嚬芊湃牒銣厮?shu y)（40）中保溫）中保溫60 min后，立即加后，立即加入入0.2ml 6N HCl，混勻，終止反應；，混勻，終止反應； （5）于波長）于波長290 nm處，以處，以0號管溶號管溶液調(diào)零，分別記錄測得的各管液調(diào)零，分別記錄測得的各管A290值。值。 酶活單位定義：規(guī)定酶活單位定義：規(guī)定1小時內(nèi)小時內(nèi)A290增加增加0.01為為PAL的一個活力單位。的一個活力單位。第13頁/共16頁第十三頁，共16頁。 1、PAL總活力計算： 分別(fnbi)