鎮(zhèn)眩湯對梅尼埃病大鼠血管加壓素的影響

1、機能學(xué)實驗設(shè)計大綱實驗名稱：鎮(zhèn)眩湯對梅尼埃病豚鼠血管加壓素的影響課題來源：自選設(shè)計班級：設(shè)計人員： 設(shè)計日期：2012年12月5日指導(dǎo)老師：一、實驗設(shè)計的目的意義：實驗設(shè)計的目的意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，存在的問題，解決問題的思路：目的與意義：復(fù)制豚鼠梅尼埃病模型，探討中藥復(fù)方鎮(zhèn)眩湯治療梅尼埃病的機制。由于MD的病因不明，其發(fā)病機制和臨床診治的研究一直是耳鼻咽喉科學(xué)研究的熱點。本模型采用阻塞前庭導(dǎo)水管的傳統(tǒng)方法復(fù)制模型 ，觀察鎮(zhèn)眩湯對梅尼埃病豚鼠血管加壓素的影響，為臨床提供藥效學(xué)資料及治療學(xué)基礎(chǔ)。國內(nèi)外的現(xiàn)狀：梅尼埃病是臨床上較為常見的一種內(nèi)耳疾病，以膜迷路積水為基本病理改變。由于病因未明、且易復(fù)

2、發(fā)，國內(nèi)外中西醫(yī)學(xué)者對此病進行了大量研究。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為梅尼埃病屬中醫(yī)學(xué)眩暈范疇，臨床特點為反復(fù)發(fā)作性眩暈伴惡心、嘔吐、耳鳴及聽力進行性減退，急性發(fā)作期常有視物旋轉(zhuǎn)，如坐舟車，動則尤甚，并伴有眼球震顫、平衡失調(diào)等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對本病的認(rèn)識病因未明，但情緒緊張、憂慮和工作勞累可能是發(fā)作的誘因。組織病理學(xué)改變?yōu)閮?nèi)淋巴腔積水。臨床表現(xiàn)為突然發(fā)作的眩暈，多為旋轉(zhuǎn)或搖晃型。伴自發(fā)性眼震及植物神經(jīng)癥狀，眩暈一般持續(xù)數(shù)秒至數(shù)分鐘，很少超過12日。初期為波動性聽力減退，繼后有下降趨勢。間歇期可完全或部分恢復(fù)。發(fā)怍次數(shù)越多，聽力損失愈重。波動性耳鳴，多為低頻率吹風(fēng)樣。亦有相當(dāng)一部分病人的臨床表現(xiàn)并不典型。西醫(yī)治療方法

3、：由于對此病基本病理和發(fā)病機制的認(rèn)識還很不全面，因此很難設(shè)計出滿意的藥物和手術(shù)治療，至今藥物無多進展。（1） 一般治療以調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能，改善耳蝸微循環(huán)和解除膜迷路積水為主（2）手術(shù)治療應(yīng)用藥物保守治療6個月以上癥狀不能緩解單側(cè)梅尼埃病可考慮手術(shù)，包括頸交感神經(jīng)神經(jīng)切斷術(shù)；內(nèi)淋巴囊手術(shù)；內(nèi)淋巴 外琳巴分流；前庭神經(jīng)切斷術(shù)；選擇性迷路破壞術(shù)等。存在的問題：根據(jù)“無痰不作?！?、“無瘀不作眩”、“無風(fēng)不作眩”、“無虛不作眩”的理論總結(jié)出的鎮(zhèn)眩湯，在臨床上治療梅尼埃病取得了良好的效果。但是鎮(zhèn)眩湯的具體作用機制并不清楚。解決問題的思路：相關(guān)報道提示大鼠給予血管加壓素1周后可誘導(dǎo)內(nèi)耳淋巴積水。而且與正常人

4、相比，梅尼埃病患者的血管加壓素水平在急性發(fā)作前后均升高。本實驗通過阻塞前庭導(dǎo)水管的方法復(fù)制梅尼埃病模型，觀察大鼠用藥前后聽覺誘發(fā)電位聽閾的變化及大鼠血漿中血管加壓素的含量，確定鎮(zhèn)眩湯治療梅尼埃病的機制與其調(diào)節(jié)血漿血管加壓素是否有關(guān)。參考文獻：1 牟忠林，韓德民，汪若峰實驗性膜迷路積水的造模方法及其特點J國外醫(yī)學(xué)：耳鼻咽喉科學(xué)分冊，2004，28(4)：1941962 Paparella MMBenign paroxysmal positional vertigo and other vestibular symptoms in M6ni6re diseaseJEar Nose Throat J

5、，2008，87(10)：5623 馮勃梅尼埃病病因及發(fā)病機制的研究進展實用醫(yī)學(xué)雜志,2005,21(2)：118 4 陳學(xué)習(xí)，張英杰.梅尼埃病動物模型研究進展與思考，中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009,11（11），1893-20025 Barrett LK ，Singer M ，Clapp LHVasopressin：meehanisms of action on the vasculature in health and in septic shockJCrit Care Med，2007，35(1)：33406 Treschan TA，Peters JThe vasopressin system：

6、physiology and clinical strategiesJAnesthesio1ogy，2006，105(3)：599612，6396407 黃兆勝中藥學(xué)M北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：8183二、實驗設(shè)計方案（實驗設(shè)計目標(biāo),擬解決的主要問題, 實驗動物設(shè)計,實驗專業(yè)設(shè)計，實驗統(tǒng)計設(shè)計,實驗方法設(shè)計，可行性分析,預(yù)期結(jié)果，實驗設(shè)計工作時間安排）。（一）實驗設(shè)計目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題設(shè)計目標(biāo)：探討中藥復(fù)方鎮(zhèn)眩湯治療梅尼埃病的機制，從而探討鎮(zhèn)眩湯治療梅尼埃病的機制與其調(diào)節(jié)血漿血管加壓素是否有關(guān)。擬解決的關(guān)鍵問題：梅尼埃病模型的建立；梅尼埃病模型進行分組與實驗資料的統(tǒng)計分析。（二）實驗

7、設(shè)計1、實驗動物設(shè)計我們選用Glatthaar豚鼠作為實驗動物，有以下幾點理由：1）、豚鼠聽覺靈敏且其顳骨與人類顳骨相似. 2）、豚鼠耳殼大，存在明顯的聽覺耳動反射。耳窩對聲波極為敏感，特別是對 700 2000周/秒的純音最敏感。所以豚鼠常用于聽覺和內(nèi)耳疾病的研究3）、Glatthaar豚鼠市場上最常見也很便宜。2、實驗專業(yè)設(shè)計選用清潔級健康，鼠齡68周，體質(zhì)量(2O0±20)g，且耳鏡檢查耳廓反射正常，雙耳耳膜完整，耳廓反應(yīng)靈敏，無眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只作為實驗對象。采用阻塞前庭導(dǎo)水管的方法復(fù)制梅尼埃病模型，給予真性手術(shù)與假性手術(shù)處理，探討真性手術(shù)與假性

8、手術(shù)后Glatthaar豚鼠聽覺誘發(fā)電位聽閾的變化及大鼠血漿中血管加壓素的含量 。觀察：各組豚鼠腦干誘發(fā)電位測定聽閾（dbl）; 各組豚鼠血漿中血管加壓素含量（pg/ml）實驗指標(biāo)。3、實驗統(tǒng)計設(shè)計在科研實驗統(tǒng)計設(shè)計中我們應(yīng)始終貫徹隨機、對照、重復(fù)三大原則。（1）隨機：選清潔級健康，鼠齡68周，體質(zhì)量(2O0±20)g，耳鏡檢查耳廓反射正常，雙耳耳膜完整，耳廓反應(yīng)靈敏，無眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只，將48只Glatthaar豚鼠按體重由小變大編號后，從隨機數(shù)字表中查取隨機數(shù)字，依次抄錄于豚鼠編號下預(yù)先規(guī)定，隨機數(shù)字從11行第一個數(shù)字開始接著抄寫48個，按照能被6

9、除的規(guī)律：不余到A組，余1到B1組，余2到B2組，余3到B3組，余4到B4組，余5到B5組，,每組8只。動物編號：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20.48隨機數(shù)字：57 35 27 33 72 24 53 63 94 09 41 10 76 47 91 44 04 95 29所屬組別：B3 B5 B3 B3 A A A B3 B4 B5 B4 B4.B5以上不難看出各實驗組與對照組數(shù)量各8只與動物編號，更有利用我們實驗的進行。以便我們2周后在實驗組與對照組各取實驗動物進行觀察指標(biāo)的測定。（2）對照：本課題的研究我們采取了真性手術(shù)

10、與假性手術(shù)之間的對照。（3）重復(fù)：本實驗采用的是每實驗小組有8只豚鼠，具有一定的重復(fù)性。（4）統(tǒng)計數(shù)據(jù)收集：本實驗搜集計量資料，初步確定對各組實驗數(shù)據(jù)的比較分為實驗值和基礎(chǔ)值比較。表1-1 用藥前后各組豚鼠聽覺誘發(fā)電位聽閾比較(±s ) 組別 n 聽閾/dBL 用藥前 用藥后A假手術(shù) 8B1模型 8B2倍他司丁 8B3鎮(zhèn)眩湯低劑量 8B4鎮(zhèn)眩湯中劑量 8B5鎮(zhèn)眩湯高劑量 8表1-2各組豚鼠血漿中血管加壓素含量比較(±s)組別 n 血管加壓素含量/（pg/ml）A假手術(shù) 8B1模型 8B2倍他司丁 8B3鎮(zhèn)眩湯低劑量 8B4鎮(zhèn)眩湯中劑量 8B5鎮(zhèn)眩湯高劑量 8（5）統(tǒng)計數(shù)據(jù)分

11、析本實驗所得到的資料為計量資料，并且實驗組與對照組為兩個獨立的樣本，所以2個周實驗組與對照我們采用t檢驗來表示。B1、B2、B3組模型行兩樣本比較t檢驗，均以0.05作為顯著性檢驗水準(zhǔn)，如B1與B2組之間模型形成時間的比較，其方法如下：（1）建立檢驗假設(shè)H0： = （實驗組于對照組豚鼠聽覺誘發(fā)電位聽閾和血漿血管加壓素相等）。H1： 、 不等或不全相等，0.05。（2）計算統(tǒng)計量 X=(X1+X2+X3+Xn)/nµ=(Xi-X)2/(n-1) t=（x-u）/Sx( 3 ) 查t值表，確定P值，得出結(jié)論。4、實驗方法設(shè)計實驗技術(shù)路線豚鼠（左耳阻塞前庭導(dǎo)水管，右耳正常） B2倍他司丁組

12、（倍他司丁混懸液（09 mgml）予倍他司丁混懸液灌胃B4鎮(zhèn)眩湯中予鎮(zhèn)眩湯(30gm1)灌胃B3鎮(zhèn)眩湯高組予鎮(zhèn)眩湯 (60 gm1)灌胃 B1模型組生理鹽水灌胃A組假手術(shù)組，生理鹽水灌胃B5鎮(zhèn)眩湯低組予鎮(zhèn)眩湯 (15 gm1)灌胃A組聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量聽覺誘發(fā)電位聽閾和鼠血漿中血管加壓素含量實驗技術(shù)方法（1）隨機抽樣：隨機清潔級健康，鼠齡68周，體質(zhì)量(2O0±20)g，耳鏡檢查耳廓反射正常，雙耳耳膜完整

13、，耳廓反應(yīng)靈敏，無眼震，排除中耳疾患的Glatthaar豚鼠48只。分別編號，再隨機分成A組B1組B2組B3組B4組B5組六組。詳細(xì)見上動物分組。（2）實驗分組：B1組B2組B3組B4組B5組為實驗組，給予手術(shù)處理；A組為對照組，給予假手術(shù)處理。（3）實驗手術(shù)：稱重，編號隨機分為鎮(zhèn)眩湯高(60 gm1)、中(30gm1)、低劑量(15 gm1)組，倍他司丁組(倍他司丁混懸液09 mgm)，模型組和假手術(shù)組，每組8只，自由飲食。手術(shù)4周后評價模型是否復(fù)制成功。假手術(shù)組手術(shù)時以見到乙狀竇后為止。以上各組均選左耳為手術(shù)耳，右耳為對照耳。鎮(zhèn)眩湯高、中、低劑量組分別以相應(yīng)濃度的藥物灌胃，倍他司丁組給予倍

14、他司丁混懸液灌胃，模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃。共2周。麻醉，用l0%水合氯醛溶液按40 mlkg腹腔注射麻醉，然后將豚鼠固定在動物手術(shù)臺上；豚鼠處于深麻醉后，將動物專用電極用乙醇無菌操作后晾干，刺入相應(yīng)位置。采用美國智聽公司Smart EP誘發(fā)電位系統(tǒng)測試，測試軟件版本號為383。測試參數(shù)：聲刺激為“單擊”短聲，強度8O聲壓級(soundpressure level，SPL)，刺激頻率10次s，帶通濾波1003 000 Hz，觀察時程20 ms，疊加次數(shù)1 000次，耳機固定于距外耳道口05 cm。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，

15、ELISA)試劑盒檢測豚鼠血管加壓素，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。（4）模型復(fù)制：六組豚鼠都要復(fù)制梅尼埃病模型。方法：豚鼠麻醉后行顱頂正中切口，磨去術(shù)側(cè)枕骨暴露硬腦膜及乙狀竇，剝離硬腦膜至乙狀竇前緣，在前庭導(dǎo)水管顱內(nèi)開口處切斷內(nèi)淋巴囊。再用微電鉆沿前庭導(dǎo)水管方向鉆人，破壞骨內(nèi)部分淋巴囊和部分內(nèi)淋巴導(dǎo)管，然后填以骨蠟、明膠海綿，縫合切口。模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)眼震，行走不穩(wěn)，不停擺頭，腦干聽力誘發(fā)電位示聽閾下降。具備其中之一即可。（5）處理措施：1）實驗動物的飼養(yǎng)：單籠飼養(yǎng)，每天給予含有青霉素注射液喂養(yǎng)，防止感染；由于豚鼠不能合成維生素C，因此，飼料中一定要注意維生素C 的補充；注意飼料及青草蔬

16、菜的來源和衛(wèi)生質(zhì)量；飼料中粗纖維的含量應(yīng)不低于30；溫度應(yīng)控制在1829的范圍內(nèi)，濕度40702）觀察指標(biāo)測定前準(zhǔn)備：檢查各種所需要的儀器設(shè)備是否完好，用一只正常Glatthaar豚鼠做一次指標(biāo)的測定，檢查儀器設(shè)備性能狀況。4）實驗數(shù)據(jù)的收集整理：（三）可行性分析:1、Glatthaar豚鼠來源方便，容易侍養(yǎng)，在科研工作中被廣泛利用。2、實驗操作簡單，可在實驗室完成。3、復(fù)制模型時間短，藥品鎮(zhèn)眩湯容易得到。（四）預(yù)期效果:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠聽覺誘發(fā)電位聽閾和血漿血管加壓素水平顯著升高；與模型組比較，鎮(zhèn)眩湯高、中劑量組大鼠聽閾和血管加壓管水平顯著降低(P<O05)。鎮(zhèn)眩湯治療梅尼埃

17、病的機制與其調(diào)節(jié)血漿血管加壓素有關(guān)。（五）實驗設(shè)計工作時間安排:1、第1天，準(zhǔn)備實驗器械，藥品，動物，并將動物隨機分成六組，編號。2、第2-16天完成實驗動物模型制備。3、進行對照組和實驗組的實驗，記錄數(shù)據(jù)并分析計算，得出結(jié)論。4、單籠飼養(yǎng)，每天給予含有青霉素注射液喂養(yǎng)，防止感染。補充維生素和粗纖維。三、完成實驗條件： 1、儀器設(shè)備情況：鼠臺，針頭，注射器6只。，動物手術(shù)器械，嬰兒磅秤，美國智聽公司Smart EP誘發(fā)電位系統(tǒng)、微電鉆2、實驗動物情況：清潔級健康，鼠齡68周，體質(zhì)量(2O0±20)g，且耳鏡檢查耳廓反射正常，雙耳耳膜完整，耳廓反應(yīng)靈敏，無眼震，排除中耳疾患的Glatt

18、haar豚鼠，數(shù)量48只。3、藥品試劑來源：茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草、熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎、澤瀉各10g。倍他司丁(衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)青霉素。雙氧水。生理鹽水。l0%水合氯醛溶液。乙醇。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑、骨蠟、明膠海綿。4、價格估計茯苓 20元/斤 桂枝：廣西玉林藥材市場 、2.80元/kg 白術(shù)：廣西玉林藥材市場、14.00元/kg甘草：四川荷花池藥材市場、16.5元/kg 熟地黃：安徽亳州市中藥市場、10.5元/kg白芍：四川荷花池藥材市場、19.00元/kg當(dāng)歸：廣西玉林藥材市場 、26.00元/kg川芎：四川荷花池藥材市場 、12.20元/kg澤瀉 ：四川荷花池藥材市場 、9.00元/公斤青霉素:2.5元/一盒雙氧水：8元一瓶祥恩吸