RNA序列同源性分析與細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定

1、16s rRNA序列同源性分析與細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定焦振泉?jiǎng)⑿忝肪C述孟昭赫審校 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所(北京100050)摘要本文介紹了16s rRNA序列測定及同源性分析的方法,并闡述了其在細(xì)菌系統(tǒng)分類鑒定中的重要作用。關(guān)鍵詞16s rRNA序列同源性分析細(xì)菌分類鑒定近10多年來，隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是作為生物技術(shù)里程碑的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的出現(xiàn)及核酸測序技術(shù)的不斷完善，產(chǎn)生了許多新的分類方法，如：質(zhì)粒圖譜、限制性片段長度多態(tài)性分析、脈沖場凝膠電泳、PCR指紋圖、rDNA指紋圖、16srRNA序列分析等。它們主要是對細(xì)菌染色體進(jìn)行直接的DNA分析或?qū)θ?/p>

2、色體外的DNA片段進(jìn)行分析，從遺傳進(jìn)化的角度去認(rèn)識細(xì)菌，從分子水平進(jìn)行分類與鑒定，使細(xì)菌的分類越來越科學(xué)和精確，特別是16srRNA序列分析方法的出現(xiàn)使細(xì)菌進(jìn)化可以通過試驗(yàn)研究來證實(shí)。這是細(xì)菌分類史上的一次革命，必將使人們對生物進(jìn)化及其與其它生物學(xué)科關(guān)系的認(rèn)識更加深入。一、16srDNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)16s rRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA。目前，在細(xì)菌的系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用的和最常用的分子鐘是rRNA，其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%)，分子大小適中，存在于所有的生物中，特別是其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。rRNA在大多

3、數(shù)原核生物中都具有多個(gè)拷貝1，5s、16s和23s rRNA的拷貝數(shù)相同2，16s rRNA由于大小適中，約1.5kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)來較容易地得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家及分類學(xué)家所接受3。所以，“細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)研究特設(shè)委員會”建議依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分類。通過對其序列的分析，可以判定不同菌屬、菌種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近。細(xì)菌的16srRNA的可變區(qū)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)如下4：可變區(qū)(variable region，V110)V1： 61106bpV2：121240bpV3： 436500bp V4：588671bpV5： 734754bp V6：829857bpV7： 9901045b

4、p V8：11181160bpV9： 12401298bpV10：14101492bp恒定區(qū)(constant region)可變區(qū)序列因不同細(xì)菌而異，恒定區(qū)序列基本保守，所以，可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物將16srRNA片段擴(kuò)增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。但較其它方法而言，16srRNA序列測定分析更適用于確定屬及屬以上分類單位的親緣關(guān)系。216s rRNA序列測定與分析方法對不同細(xì)菌的16srRNA序列進(jìn)行同源性比較分析是推斷細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育及進(jìn)化關(guān)系的一個(gè)重要方法。這些序列主要通過寡核苷酸編目(oligonucleotide cataloging)、克隆序

5、列的測定、反轉(zhuǎn)錄直接測序、對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序等方法獲得。2.1寡核苷酸編目采用已知堿基專一性的核酸酶(如RNaseT1)徹底消化RNA，消化產(chǎn)物用層析和電泳雙向分離，放射自顯影記錄結(jié)果得初級指紋圖，再對初級指紋圖上的每一個(gè)點(diǎn)進(jìn)行序列分析，最后依字母順序和鏈的長短將所試rRNA的所有寡核苷酸列出一個(gè)目錄式清單進(jìn)行編目，并據(jù)此計(jì)算不同rRNA間的相似數(shù)(SAB)SAB = 2NAB/(NA + NB)NA、NB分別為兩樣品中各自具有的長度為L個(gè)核苷酸以上的寡核苷酸殘基數(shù)目，NAB是兩樣品中共同具有的寡核苷酸殘基數(shù)最后用SAB構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹5。Woese等6利用RNase T1對16srRN

6、A進(jìn)行寡核苷酸編目，建立了原核生物系統(tǒng)發(fā)育的總體框架。寡核苷酸編目只利用了rRNA上40%的信息，現(xiàn)今，由于核酸快速測定技術(shù)的發(fā)展，該法已被其它的序列分析法所取代。2.2其它幾種方法這些方法主要是利用16srRNA恒定區(qū)序列特別保守的特點(diǎn)，在恒定區(qū)上設(shè)計(jì)引物，將細(xì)菌16srRNA擴(kuò)增出來，讀取16srRNA序列，對不同細(xì)菌的16srRNA進(jìn)行同源性比較及分析。目前比較通用的幾種16srRNA PCR擴(kuò)增引物見附表7。附表目前比較通用的幾種16srRNA PCR擴(kuò)增引物1引物縮寫：f：正向r：反向D：遠(yuǎn)端P：近端。帶f的包含ECoR和Sal的位點(diǎn);r包含Hind和BamH和Xmal識別序列;反向

7、引物產(chǎn)生rRNA的互補(bǔ)序列;rP1、rP2、rP3除從3端開始的第17個(gè)堿基不同外全部相同。2所有引物序列方向都從53，連接序列包含用小寫字母寫的克隆用酶切位點(diǎn);由于細(xì)菌染色體上的rRNA基因以復(fù)數(shù)存在(約10個(gè)左右)8，當(dāng)譯讀PCR產(chǎn)物的直接序列時(shí)，復(fù)數(shù)拷貝如不全是相同序列就譯讀不出來，即使拷貝間有不同時(shí)，也只限于變異較大的區(qū)段，穩(wěn)定區(qū)段拷貝間并無不同。rRNA基因拷貝間有不同時(shí)，只能克隆后再測序，而且克隆之后有利于重復(fù)測序及以后的工作，所以建議將PCR擴(kuò)增的16srDNA序列進(jìn)行克隆?？寺r(shí)可根據(jù)對大部分細(xì)菌16srDNA序列的檢索，選擇合適的酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物的5端修飾進(jìn)行粘端

8、克隆。常用的克隆載體為PUC系列及M13系列。這樣有益于產(chǎn)生單鏈進(jìn)行測序，但如果所測序列為未知序列，難于找到合適的酶切位點(diǎn)進(jìn)行粘端克隆時(shí)，可利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3端總帶有一個(gè)A的特點(diǎn)，選擇一個(gè)5端帶有一個(gè)T的載體，現(xiàn)在，T-Vec-tor易于制備且有商品出售，故一般采用PGEM-T-Vector系統(tǒng)進(jìn)行克隆。另外還可以通過對16srRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行直接測序。David等9闡述了一種用于細(xì)菌系統(tǒng)分離的快速rRNA序列測定方法，該法以rRNA為模板，以一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸作引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，進(jìn)行Sanger雙脫氧鏈終止法測序。但由于RNA在RNase作用下極易降解，而且很難保證不受

9、RNase的污染，所以采用測定16srDNA序列。即提取細(xì)菌總的染色體DNA，利用保守的16srRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到細(xì)菌的16srDNA，這時(shí)可利用保守引物對擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，亦可將此16srRNA克隆后再測序。由于16srRNA約1.5kb，一套反應(yīng)不能全部讀取，所以可利用所取得的核苷酸序列設(shè)計(jì)新的寡核苷酸，充當(dāng)后一套反應(yīng)的引物，從而循序漸進(jìn)地獲得所有16srRNA片段的序列10。2.3序列分析方法取得16srRNA序列后，從基因數(shù)據(jù)庫中調(diào)取所需16srRNA序列，利用一些必要的計(jì)算機(jī)分析軟件對它們進(jìn)行同源性比較，進(jìn)而繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。現(xiàn)在比較通用的核酸序列數(shù)據(jù)庫有GenBANK (

10、national institutes of health)、EMBL (European molecular biology labora-tory)、DDBJ (DNA data bank of Japan)11。比較通用的序列分析軟件有Squence、Philips、Treecon和GCG。計(jì)算不同菌屬、菌種之間的遺傳距離的方法主要有Jukes和Cantor方法12、Tajima和Nei方法13、Kimura方法14及Jin和Nei方法15。其中前兩種方法為單一參數(shù)模式，后兩種方法為雙參數(shù)模式。在取得遺傳距離之后構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)有許多種方法，其中有4種方法主要是根據(jù)聚類分析來進(jìn)行的16，它們

11、分別為利用算術(shù)平均數(shù)的加權(quán)配對分組方法(weightedpair group method using arithmatic aver-ages， WPGMA)，利用算術(shù)平均數(shù)的非加權(quán)配對分組方法(unweighted pair groupmethod using arithmatic averages，UPGMA)，單個(gè)連鎖分析(single linkage)及完全連鎖分析(completed linkage)。316srRNA序列分析在細(xì)菌分類鑒定中的作用16srRNA的同源性分析最適用于屬及屬以上的遠(yuǎn)緣關(guān)系。目前，已對2000種(約相當(dāng)于50%)以上的真細(xì)菌的16srRNA進(jìn)行了測序，不

12、同菌屬的16srRNA序列同源性為70%95%，對分類而言，至少需要測1000 bp以上。通過同源性比較，可以了解不同菌屬、菌種在遺傳進(jìn)化方面的距離。經(jīng)過16srRNA同源性的比較，結(jié)果有時(shí)與傳統(tǒng)分類結(jié)果不符，發(fā)現(xiàn)一些新的種屬。Funke等17測定從人體分離到的棒桿菌依賴補(bǔ)體細(xì)胞毒性組及其類似棒桿菌的16srRNA序列。通過對這些序列的比較發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)棒桿菌組都屬于放線菌屬，再結(jié)合其它的分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果及以前的生化試驗(yàn)結(jié)果，提出其為放線菌一個(gè)新種，即鈕氏放線菌種(Actinomyces neuii.)，包含鈕氏放線菌鈕氏亞種(Actinomyces neuii subsp.neuii.)(棒桿菌依賴

13、細(xì)胞毒性組)和鈕氏放線菌無硝亞種(Actinomyces neuii subsp.antitratus)(棒桿菌類似依賴細(xì)胞毒性組)。Bennasar等18測定并比較了14株施氏假單胞菌，其中包括模式株CCUG11256和Zobell株(ATCC14405)，它們代表了已知的施氏假單胞菌的7個(gè)不同基因型(DNA-DNA雜交同源組)，結(jié)果與DNA-DNA雜交所得到的基因型高度相關(guān)，并且鑒定了每個(gè)基因型的核酸特征位置，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)第6基因型SP1402T(T=模式株)和SL401與施氏假單胞菌模式株明顯不同，從而建議它們應(yīng)該屬于一個(gè)新種，命名為Pseudomonasbalearica。有時(shí)16srR

14、NA序列同源性比較結(jié)果對傳統(tǒng)的分類結(jié)果給予了證實(shí)并提供了更多的分類依據(jù)。Gaydos等19通過對肺炎衣原體的1554bp 16srRNA序列與鸚鵡熱衣原體及砂眼衣原體的16srRNA序列進(jìn)行同源性比較并繪制了系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)肺炎衣原體與后二者的同源性分別為96.19%和94.07%，證實(shí)了以前根據(jù)其它方法研究所得出的結(jié)論，同時(shí)說明從遺傳進(jìn)化角度來看，肺炎衣原體與鸚鵡熱衣原體的進(jìn)化關(guān)系比與砂眼衣原體的關(guān)系更近。蠕蟲新立克次氏體是沙門氏菌中毒疾病的致病因子，它是唯一一種已知的通過蠕蟲傳播的專一性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，通過測定它的1453bp的16srRNA序列并與Protecobac-teria的組的細(xì)胞內(nèi)

15、序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，蠕蟲新立克次氏體與埃里希氏體屬的兩個(gè)種即里氏埃里希氏體和腺熱埃里希氏體特別相似(相似性>95%)，而埃里希氏體屬的其它種則與之相距較遠(yuǎn)。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了以前通過超微結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)所得的結(jié)論。埃里希氏體屬可被分為3個(gè)相似的種，每一個(gè)種都與其它非埃里希氏體屬的一個(gè)菌種相近。蠕蟲新立克次氏體、里氏埃里希氏體和腺熱埃里希氏體之間的相近及與埃里希氏族其它菌屬的顯著不同，意味著這些菌種將作為從埃里希氏體屬中分離出來的一個(gè)新的細(xì)菌屬而存在20。目前起確定微生物種決定作用的是DNA-DNA同源性的程度，一般的標(biāo)準(zhǔn)是70%以上同源定為種的范圍。16srRNA序

16、列和DNA-DNA同源性相關(guān)關(guān)系的研究表明21：序列的相同性不在99.8%以上就不能達(dá)到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA總共約有1500bp，0.2%的不同相當(dāng)于3個(gè)堿基。由于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)不一定完全而且個(gè)人讀取數(shù)據(jù)也可能出現(xiàn)錯(cuò)讀，因此由16srRNA序列鑒定種是很難的，必須結(jié)合與近緣菌種的DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)。利用16srRNA測序鑒定病原菌是很有必要的。Relman等22利用16srRNA序列中的保守區(qū)段設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物，用來擴(kuò)增桿菌性血管瘤病人的靶DNA序列。他們還發(fā)現(xiàn)在具有一定病癥的病人的組織污染物中已發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌形成，但并沒有培養(yǎng)出致病菌，從這些樣品的16srRNA

17、擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析可以看出：致病菌為一種立克次氏體屬組織，現(xiàn)在稱為漢氏巴爾通氏體23，24。近幾年來，人歐利希氏病25、腸原性脂肪代謝障礙26，27和少菌性骨髓炎28的致病因子也是通過PCR擴(kuò)增16srRNA進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)的；同樣，疏螺旋體的不同區(qū)域分離物根據(jù)此法也已被鑒定29。在北美洲和歐洲的蜱傳染性螺旋體病人身上存在的不同疏螺旋體屬的16srRNA序列分析解釋了為什么這兩大洲的蜱傳染性螺旋體病的癥狀不同。隨著大部分細(xì)菌的16srRNA序列的獲得以及核酸擴(kuò)增16srRNA序列測定自動(dòng)化分析系統(tǒng)的問世，必將引起細(xì)菌分類的一次重大變革，它可以使人們進(jìn)一步了解細(xì)菌的進(jìn)化關(guān)系，從而產(chǎn)生以16srR

18、NA序列分析為主體的所有細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。參考文獻(xiàn)1 Kenerly ME et al. J Bacteriol， 1997;132：931-9492 Ginsberg D and Steitz JA. J Biol Chem， 1975;250：5647-56543 Sogin and Gunderson. Acad Sci， 1987;1503：125-1394現(xiàn)代細(xì)菌分類鑒定法.中日細(xì)菌分類鑒定和診斷分子生物學(xué)新技術(shù)研討班講義5 Staclcebrandt E et al. Methods Microbiol，1985;118：75-1076 Fox GE and Woese CR. S

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